プロテアーゼの耐熱性に影響を与える自己分解反応の速度論的解析

• 研究課題/領域番号: 25400426
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生物物理・化学物理・ソフトマターの物理
• 研究機関: 長岡技術科学大学
• 研究代表者: 城所 俊一 長岡技術科学大学, 工学研究科, 教授 (80195320)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円); 2015年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円); 2014年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円); 2013年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
• キーワード: 蛋白質分解酵素 / 速度論的安定性 / 自己失活 / 熱測定 / 速度定数 / １次反応 / ２次反応 / 活性化エンタルピー / thermolysin / 立体構造変化 / savinase / 反応速度定数 / カルシウム濃度 / 酵素濃度 / タンパク質分解酵素

研究成果の概要

立体構造変化に加えて、自己分解反応を考慮した速度論的モデルを構築し、プロテアーゼの種々条件下の熱測定データを共通のパラメターで解析するグローバル解法を開発した。金属プロテアーゼであるthermolysin(TLN)とセリンプロテアーゼであるsavinase(SAV)の速度論的安定性が本手法で評価できることを示した。さらに、TLNの安定性への阻害剤の効果と、SAVの安定性へのCaイオンの効果とを評価し、それらの機構を明らかにした。また、本手法の汎用性を検証するため、マルチユニットからなる非プロテアーゼ蛋白質にも適用し、カルモジュリンやアミロマルターゼ等の速度論的安定性の評価に成功した。

研究成果

• [国際共同研究] チュラロンコン大学(タイ)
• [雑誌論文] Similarity and differences in the physicochemical properties of lactate dehydrogenase isozymes from different tissues of Japanese sandfish Arctoscopus japonicus (2016)
  • 著者名/発表者名: Sugawara K, Nakagawa M, Yonezawa M, Nakamura S, Kidokoro S, Wakui H, Nunomura W
  • 雑誌名: Fish. Sci. 巻: 82 号: 3 ページ: 519-527
  • DOI: 10.1007/s12562-016-0972-1
  • NAID: 40020863358
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutagenesis for improvement of activity and thermostability of amylomaltase from Corynebacterium glutamicum (2016)
  • 著者名/発表者名: Nimpiboon P., Kaulpiboon J., Krusong K., Nakamura S., Kidokoro S., Pongsawasdi P.
  • 雑誌名: Int. J. Biol. Macromol. 巻: S0141-8130 ページ: 30154-4
  • DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2016.02.022
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] IATC, DSC and PPC analysis of reversible and multi-state structural transition of cytochrome c (2016)
  • 著者名/発表者名: Kidokoro S, Nakamura S
  • 雑誌名: Method. Enzymol. 巻: 567 ページ: 391-412
  • DOI: 10.1016/bs.mie.2015.08.002
  • 査読あり
• [雑誌論文] The impact of a single-nucleotide mutation of bgl2 on cellulose induction in a Trichoderma reesei mutant (2016)
  • 著者名/発表者名: Shida Y, Yamaguchi K, Nitta M, Nakamura A, Takahashi M, Kidokoro S, Mori K, Tashiro K, KuharaS, Matsuzawa T, Yaoi K, Sakamoto Y, Tanaka N, Morikawa Y, Ogasawara W
  • 雑誌名: Biotechnol. Biofuel 巻: 8:230 号: 1 ページ: 1-18
  • DOI: 10.1186/s13068-015-0420-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Characterization of amylomaltase from Thermus filiformis and mutation to increase in alkaline and thermo-stability (2016)
  • 著者名/発表者名: Kaewpathomsri P, Takahashi Y, Nakamura S, Kaulpiboon J, Kidokoro S, Murakami S, Krusong K, Pongsawasdi P
  • 雑誌名: Process. Biochem. 巻: 50 号: 11 ページ: 1814-1824
  • DOI: 10.1016/j.procbio.2015.08.006
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Analysis and control of protein crystallization using short peptide tags that change solubility without structure, thermal stability and function (2015)
  • 著者名/発表者名: Islam M, Nakamura S, Noguchi K, Yohda M, Kidokoro S, Kuroda Y
  • 雑誌名: Crystal Growth Design 巻: 15 号: 6 ページ: 2703-2711
  • DOI: 10.1021/acs.cgd.5b00010
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Yamaguchi A, Niimura N, Nakamura S, Kidokoro S, Chatake T, Yokoyama T, Tanaka I (2015)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi A, Niimura N, Nakamura S, Kidokoro S, Chatake T, Yokoyama T, Tanaka I
  • 雑誌名: JPS Conf. Proc. 巻: 8:03308 ページ: 1-16
  • DOI: 10.7566/jpscp.8.033008
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Analysis and Control of Protein Crystallization Using Short Peptide (2015)
  • 著者名/発表者名: Islam MM, Nakamura S, Noguchi K, Yohda M, Kidokoro S, Kuroda Y
  • 雑誌名: Cristal Growth & Design 巻: 印刷中
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] ATP Binding and Hydration State Analyses of DAPK: (2015)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi A, Niimura N, Nakamura S, Kidokoro S, Chatake T, Yokoyama T, Tanaka I
  • 雑誌名: JPS Conference Proceedings 巻: 印刷中
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Unique structural changes in calcium-bound calmodulin upon interaction with protein 4.1R FERM domain: novel insights into the calcium-dependent regulation of 4.1R FERM domain binding to membrane proteins by calmodulin (2014)
  • 著者名/発表者名: Nunomura W, Isozumi N, Nakamura S, Jinbo Y, Sasakura D, Ohki S, Kidokoro S, Wakui H, Takakuwa Y
  • 雑誌名: Cell Biochemistry and Biophysics 巻: 69 ページ: 7-19
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] タンパク質の熱力学的安定性と分子機能の精密熱量測定 (2014)
  • 著者名/発表者名: 城所俊一
  • 雑誌名: 熱測定 巻: 41 ページ: 2-9
• [雑誌論文] Unique structural changes in calcium-bound calmodulin upon interaction with protein 4.1R FERM domain: novel insights into the calcium-dependent regulation of 4.1R FERM domain binding to membrane proteins by calmodulin (2014)
  • 著者名/発表者名: Nunomura W, Isozumi N, Nakamura S, Jinbo Y, Sasakura D, Ohki S, Kidokoro S, Wakui H, Takakuwa Y
  • 雑誌名: Cell Biochem. Biophys. 巻: 69 号: 1 ページ: 7-19
  • DOI: 10.1007/s12013-013-9758-6
• [雑誌論文] Constant Enthalpy Change Value during Pyrophosphate Hydrolysis within the Physiological Limits of NaCL (2013)
  • 著者名/発表者名: Wakai S, Kidokoro S, Masaki K, Nakasone K, Sambongi Y
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 号: 41 ページ: 29247-29251
  • DOI: 10.1074/jbc.m113.502963
  • NAID: 120006811252
• [雑誌論文] A New Multi-Binding Model for Isothermal Titration Calorimetry Analysis of the Interaction between Adenosine 5’-Triphosphate and Magnesium Ion (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakamura S, Koga S, Shibuya N, Seo K, Kidokoro S
  • 雑誌名: Thermochim. Acta 巻: 563 ページ: 82-89
  • DOI: 10.1016/j.tca.2013.04.008
  • 査読あり
• [学会発表] マルチドメイン蛋白質の不可逆熱転移の速度論的解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中村成芳、中川瑞希、米澤美香、涌井秀樹、布村渉、城所俊一
  • 学会等名: 熱測定討論会
  • 発表場所: 東京電機大学 埼玉鳩山キャンパス
  • 年月日: 2015-10-08
• [学会発表] 2本のジスルフィド結合を導入した低温ショック蛋白質変異体の結合性と安定性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中澤晶子、森谷圭介、中村成芳、志田洋介、小笠原渉、城所俊一
  • 学会等名: 熱測定討論会
  • 発表場所: 東京電機大学 埼玉鳩山キャンパス
  • 年月日: 2015-10-08
• [学会発表] 低温ショック蛋白質のcavity内アミノ酸置換が 安定性や1本鎖DNAとの結合性に与える影響 (2015)
  • 著者名/発表者名: 土井淳, 中村成芳, 志田洋介, 小笠原渉, 城所俊一
  • 学会等名: 熱測定討論会
  • 発表場所: 東京電機大学 埼玉鳩山キャンパス
  • 年月日: 2015-10-08
• [学会発表] 圧力摂動熱量測定によるシトクロムｃのモルテングロビュール状態 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中村成芳、城所俊一
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会
  • 発表場所: あわぎんホール（徳島市）
  • 年月日: 2015-06-24
  • 招待講演
• [学会発表] ウイルス由来スーパーファミリー1ヘリカーゼのNTP加水分解の評価 (2015)
  • 著者名/発表者名: 福嶋 大智，瀬尾 和聖，城所 俊一，加藤 悦子
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会
  • 発表場所: あわぎんホール（徳島市）
  • 年月日: 2015-06-24
• [学会発表] 低カルシウム濃度条件のsavinaseの速度論的安定性解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 越智敬太、城所俊一
  • 学会等名: 第５０回記念熱測定討論会
  • 発表場所: 大阪大学吹田キャンパス
  • 年月日: 2014-09-28 – 2014-09-30
• [学会発表] 蛋白質の熱転移における可逆的なオリゴマー形成過程の熱力学的解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 中村成芳、Mohammad M Islam, 和智友香、清水凌、黒田裕、城所俊一
  • 学会等名: 第５０回記念熱測定討論会
  • 発表場所: 大阪大学吹田キャンパス
  • 年月日: 2014-09-28 – 2014-09-30
• [学会発表] 高い安定性と結合性とをめざした低温ショック蛋白質ジスルフィド結合導入変異体の熱量測定 (2014)
  • 著者名/発表者名: 森谷圭介、志田洋介、小笠原渉、城所俊一
  • 学会等名: 第５０回記念熱測定討論会
  • 発表場所: 大阪大学吹田キャンパス
  • 年月日: 2014-09-28 – 2014-09-30
• [学会発表] 蛋白質分解酵素の速度論的安定性の熱測定による評価 (2013)
  • 著者名/発表者名: 城所俊一、永田彰宏、越智敬太
  • 学会等名: 第５１回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 京都国際会館
• [学会発表] タンパク質の熱力学的安定性と分子機能の精密熱量測定 (2013)
  • 著者名/発表者名: 城所俊一
  • 学会等名: 第４９回熱測定討論会
  • 発表場所: 千葉工業大学
• [学会発表] Savinaseの熱変性の自己消化を考慮した速度論的解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 越智敬太、永田彰宏、城所俊一
  • 学会等名: 第４９回熱測定討論会
  • 発表場所: 千葉工業大学