ホスファチジルイノシトールの精密高純度合成のための高機能改変酵素の開発

• 研究課題/領域番号: 25420830
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生物機能・バイオプロセス
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 岩崎 雄吾 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (50273214)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円); 2015年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2014年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2013年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
• キーワード: phospholipase D / phosphatidylinositol / ホスホリパーゼD / ホスファチジルイノシトール / ホスホリパーゼ

研究成果の概要

機能性リン脂質ホスファチジルイノシトール(PI)の高純度合成を目的とし、リン脂質変換酵素であるホスホリパーゼD（PLD)の蛋白工学的改変を行った。基質ポケットに変異を導入した変異酵素から、PIを位置選択的に与える変異酵素を同定した。また，PLDの不安定ループを除去することで、安定かつ高選択性を併せ持ったPLDの作出にも成功した。さらにPIの収率を高める為に酵素反応条件を詳細に検討し、反応系に高濃度のNaClの添加という極めて単純な方法でPI収率を飛躍的に高める事に成功した。さらに、反応後の副生物であるホスファチジン酸を分解する酵素を探索し、適した酵素を産生する微生物を同定した。

研究成果

• [雑誌論文] Directing positional specificity in enzymatic synthesis of bioactive 1-phosphatidylinositol by protein engineering of a phospholipase D. (2016)
  • 著者名/発表者名: Damnjanovic, J., Kuroiwa, C., Tanaka, H., Ishida, K., Nakano, H., and Iwasaki, Y.
  • 雑誌名: Biotechnol. Bioeng. 巻: 113 号: 1 ページ: 62-71
  • DOI: 10.1002/bit.25697
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Salt-induced increase in the yield of enzymatically synthesized phosphatidylinositol and the underlying mechanism. (2016)
  • 著者名/発表者名: Muraki, M., Damnjanovic, J., Nakano, H., and Iwasaki, Y.
  • 雑誌名: J. Biosci. Bioeng. 巻: in press 号: 3 ページ: 276-282
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2016.02.011
  • NAID: 40020949769
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Deletion of a dynamic surface loop improves stability and changes kinetic behavior of phosphatidylinositol-synthesizing Streptomyces phospholipase D. (2014)
  • 著者名/発表者名: Jasmina Damnjanovic, Hideo Nakano and Yugo Iwasaki
  • 雑誌名: Biotechnology and Bioengineering 巻: 112 号: 4 ページ: 674-682
  • DOI: 10.1002/bit.25149
  • 査読あり
• [雑誌論文] 放線菌ホスホリパーゼDの改変とリン脂質合成への応用 (2013)
  • 著者名/発表者名: 岩崎雄吾
  • 雑誌名: オレオサイエンス 巻: 13 ページ: 465-469
  • NAID: 130005122085
• [学会発表] 酵素によるホスファチジル-β-1-グルコースの合成 (2016)
  • 著者名/発表者名: 井上ありさ, 安立昌篤, ダムニャノビッチヤスミナ, 中野秀雄, 岩崎雄吾.
  • 学会等名: 第６回日本生物工学会 学際的脂質創生研究部会講演会
  • 発表場所: 徳島
  • 年月日: 2016-01-22
• [学会発表] 高濃度塩の添加によるホスファチジルイノシトール酵素合成の効率化 (2016)
  • 著者名/発表者名: 村木美智子, ダムニャノビッチヤスミナ, 中野秀雄, 岩崎雄吾
  • 学会等名: 第６回日本生物工学会 学際的脂質創生研究部会講演会
  • 発表場所: 徳島
  • 年月日: 2016-01-22
• [学会発表] Protein engineering and temperature control as means of directing positional specificity in phospholipase D-catalyzed synthesis of 1-phosphatidylinositol. (2015)
  • 著者名/発表者名: Jasmina Damnjanovic, Chisato Kuroiwa, Ken Ishida, Hidetoshi Tanaka, Hideo Nakano, Yugo Iwasaki.
  • 学会等名: 第67回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 鹿児島
  • 年月日: 2015-10-26
• [学会発表] ホスファチジルイノシトール酵素合成の効率化 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村木 美智子, 中野 秀雄, 岩崎 雄吾.
  • 学会等名: 第67回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 鹿児島
  • 年月日: 2015-10-26
• [学会発表] Directing positional specificity in phospholipase D-catalyzed synthesis of 1-phosphatidylinositol. (2015)
  • 著者名/発表者名: Jasmina Damnjanovic, Chisato Kuroiwa, Ken Ishida, Hidetoshi Tanaka, Michiko Muraki, Hideo Nakano, Yugo Iwasaki.
  • 学会等名: 2015年度日本農芸化学会中部・関西支部合同大会
  • 発表場所: 射水
  • 年月日: 2015-09-19
• [学会発表] 1-ホスファチジル-β-D-グルコースの酵素合成 (2015)
  • 著者名/発表者名: 井上ありさ, 安立昌篤,中野秀雄, Jasmina Damnjanovic, 岩崎雄吾.
  • 学会等名: 2015年度日本農芸化学会中部・関西支部合同大会
  • 発表場所: 射水
  • 年月日: 2015-09-19
• [学会発表] Phospholipase D as a catalyst: application in phospholipid synthesis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki Y., Damnjanovic J., and Nakano H.
  • 学会等名: 6th International Conference on Fermentation Technology for Value-Added Agricultural Products.
  • 発表場所: Kohn Kaen, Thailand
  • 年月日: 2015-07-29
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 酵素によるホスファチジルイノシトール合成の効率化 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村木 美智子, 中野 秀雄, 岩崎 雄吾.
  • 学会等名: 生物工学若手研究者の集い（若手会）夏のセミナー2015
  • 発表場所: 北名古屋
  • 年月日: 2015-07-11
• [学会発表] ホスファチジン酸ホスファターゼの開発 (2015)
  • 著者名/発表者名: 太田 貴都, 岩崎 雄吾
  • 学会等名: 生物工学若手研究者の集い（若手会）夏のセミナー2015
  • 発表場所: 北名古屋
  • 年月日: 2015-07-11
• [学会発表] 1 -ホスファチジル-β-D-グルコースの酵素合成 (2015)
  • 著者名/発表者名: 井上 ありさ, 安立 昌篤, 中野 秀雄, ダムナニョヴィッチ ヤスミナ, 岩崎 雄吾.
  • 学会等名: 生物工学若手研究者の集い（若手会）夏のセミナー2015
  • 発表場所: 北名古屋
  • 年月日: 2015-07-11
• [学会発表] Directing positional specificity in enzymatic synthesis of 1-phosphatidylinositol by protein engineering of a phospholipase D (2014)
  • 著者名/発表者名: Damnjanovic J., Kuroiwa C., Muraki M., Ishida K., Tanaka H., Nakano H., Iwasaki Y.
  • 学会等名: The 13th China-Japan-Korea Joint Symposium on Enzyme Engineering
  • 発表場所: Jeju
  • 年月日: 2014-11-16 – 2014-11-20
• [学会発表] Protein engineering of phospholipase D for phosphatidylinositol synthesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yugo Iwasaki, Jasmina Damnjanovic, Hideo Nakano.
  • 学会等名: Japan-Italy Joint Symposium.
  • 発表場所: Nara
  • 年月日: 2014-11-05 – 2014-11-07
  • 招待講演
• [学会発表] Engineering of a phospholipase D for positionaly-specific and efficient enzymatic synthesis of 1-phosphatidylinositol. (2014)
  • 著者名/発表者名: Jasmina Damnjanovic, Chisato Kuroiwa, Michiko Muraki, Ken Ishida, Hidetoshi Tanaka, Hideo Nakano,Yugo Iwasaki.
  • 学会等名: Japan-Italy Joint Symposium.
  • 発表場所: Nara
  • 年月日: 2014-11-05 – 2014-11-07
• [学会発表] ホスホリパーゼD のタンパク質工学による位置特異的ホスファチジルイノシトール合成の最適化 (2014)
  • 著者名/発表者名: 黒岩 千智, 石田 健, 田中 秀俊, 中野 秀雄, 岩崎 雄吾
  • 学会等名: 日本農芸化学会中部支部 第171回例会
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2014-10-11
• [学会発表] Development of phospholipase D having phosphatidylinositol-synthesizing activity. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yugo Iwasaki, Jasmina Damnjanovic, Hideo Nakano.
  • 学会等名: 1st Asian Conference on Oleo Science
  • 発表場所: Sapporo
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-10
• [学会発表] 酵素の耐熱安定化のためのループトリミング法の確立とホスホリパーゼDへの応用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岩崎雄吾
  • 学会等名: 旭硝子財団 2014助成研究発表会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-07-30
• [学会発表] 放線菌ホスホリパーゼDの改変とリン脂質合成への応用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岩崎雄吾
  • 学会等名: 日本油化学会東海支部油化学セミナー
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2014-06-27
  • 招待講演
• [学会発表] 微生物ホスホリパーゼの蛋白工学的改変 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岩崎 雄吾
  • 学会等名: 日本油化学会2014 油脂産業技術部会・オレオライフサイエンス部会共催セミナー
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-06-19
  • 招待講演
• [学会発表] Enhancing the thermostability of phosphatidylinositol-synthesizing phospholipase D (2014)
  • 著者名/発表者名: Yugo Iwasaki, Jasmina Damnjanovic, Hideo Nakano
  • 学会等名: 105th AOCS Annual meeting and Expo
  • 発表場所: San Antonio, USA
  • 年月日: 2014-05-04 – 2014-05-08
  • 招待講演
• [学会発表] Engineering phospholipase D for stereoselective conversion of phosphatidylcholine into bioactive 1-phosphatidylinositol (2014)
  • 著者名/発表者名: Damnjanovic J., Kuroiwa C., Ishida K., Tanaka H., Nakano H., Iwasaki Y.
  • 学会等名: 71st Semi-annual Meeting of the Japanese Society of Enzyme Engineering
  • 発表場所: Fukuoka
  • 年月日: 2014-04-26
• [学会発表] 放線菌ホスホリパーゼDの蛋白工学的機能改変 (2013)
  • 著者名/発表者名: 岩崎雄吾
  • 学会等名: 第69回酵素工学研究会
  • 発表場所: 名古屋
  • 招待講演
• [学会発表] ホスファチジルイノシトール合成型ホスホリパーゼDの位置選択性向上 (2013)
  • 著者名/発表者名: 黒岩千智、石田健、 田中秀俊、中野 秀雄、岩崎雄吾
  • 学会等名: 日本生物工学会2013年65回大会
  • 発表場所: 広島
• [学会発表] Gate-forming loops keep the substrate bound inside the active site of Streptomyces phospholipase D. (2013)
  • 著者名/発表者名: Jasmina Damnjanovic, Hideo Nakano, Yugo Iwasaki
  • 学会等名: 日本生物工学会2013年65回大会
  • 発表場所: 広島
• [学会発表] ホスファチジルイノシトール合成活性を有するホスホリパーゼDの1-PI特異性の向上 (2013)
  • 著者名/発表者名: 黒岩千智、石田健、田中秀俊、中野秀雄、岩崎雄吾
  • 学会等名: 日本農芸化学会中部支部第168回例会
  • 発表場所: 名古屋