適正製造規範に適合する簡易精製が可能な次世代AAVベクターの開発

• 研究課題/領域番号: 25460407
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 人類遺伝学
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 平井 幸彦 日本医科大学, 医学部, 講師 (10089617)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円); 2015年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2014年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円); 2013年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: AAV ベクター精製法 / 適正製造規範準拠 / down-stream processing / AAV type 1 vector / AAV type 9 vector / AAVベクター精製法 / 遺伝子細胞治療 / rAAV 9 vector / down-steam processing

研究成果の概要

第１世代の2型や5型AAVのキャプシドのheparinやムチンに対する親和性に基づいて、第２世代のキャプシドを種々に混合した新たなAAVベクターを作成し、そのアフィニティークロマトを用いて簡易精製する方法の開発を申請した。しかし、実験を進める過程で、type 1 およびtype 9 AAVベクターの各々を、適正製造規範(GMP)への準拠が可能な簡易精製法を確立できる可能性を見出した。そこで、高価なアフィニティークロマト用カラムの必要が無く、標準作業手順上の煩雑さを含む超遠心分離を含まないtype 9 AAVベクターの作成・精製のdown-stream processingを確立した。

研究成果

• [雑誌論文] Ultracentrifugation-free chromatography-mediated large-scale purification of recombinant adeno-associated virus serotype 1 (rAAV1). (2016)
  • 著者名/発表者名: Taro Tomono, Yukihiko Hirai, Hironori Okada, Kumi Adachi, Akiko Ishii, Takashi Shimada, Masafumi Onodera, Akira Tamaoka, and Takashi Okada
  • 雑誌名: Molecular Therapy - Methods & Clinical Development 巻: 3 ページ: 15058-15058
  • DOI: 10.1038/mtm.2015.58
  • NAID: 120007128523
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Treatment of hypophosphatasia by muscle-directed expression of bone-targeted alkaline phosphatase via self-complementary AAV8 vector. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakamura-Takahashi,A., Miyake,K., Watanabe, A., Hirai, Y., Iijima, O., Miyake, N., Adachi K.,, Nitahara-Kasahara, Y., Kinoshita, H., Noguchi, T., Abe, S., Narisawa, S., Millán, J. L., Shimada, T.,Okada, T.
  • 雑誌名: Molecular Therapy- Methods & Clinical Development 巻: 3 ページ: 15059-15059
  • DOI: 10.1038/mtm.2015.59
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Enzyme replacement in the CSF to treat metachromatic leukodystrophy in mouse model using single intracerebroventricular injection of self-complementary AAV1 vector. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hironaka K, Yamazaki Y, Hirai Y, Yamamoto M, Miyake N, Miyake K, Okada T, Morita A, Shimada T.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 18 号: 1 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1038/srep13104
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Intrathecal AAV Serotype 9-mediated Delivery of shRNA Against TRPV1 Attenuates Thermal Hyperalgesia in a Mouse Model of Peripheral Nerve Injury. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirai T, Enomoto M, Kaburagi H, Sotome S, Yoshida-Tanaka K, Ukegawa M, Kuwahara H, Yamamoto M, Tajiri M, Miyata H, Hirai Y, Tominaga M, Shinomiya K, Mizusawa H, Okawa A, Yokota T
  • 雑誌名: Mol Ther 巻: 22 号: 2 ページ: 409-19
  • DOI: 10.1038/mt.2013.247
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted gene transfer into ependymal cells through intraventricular injection of AAV1 vector and long-term enzyme replacement via the CSF. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki Y, Hirai Y, Miyake K, Shimada T.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 4 号: 1 ページ: 5506-5506
  • DOI: 10.1038/srep05506
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Intraperitoneal administration of AAV9-shRNA inhibits target gene expression in the dorsal root ganglia of neonatal mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Akira Machida, Hiroya Kuwahara, Azat Mayra, Takayuki Kubodera, Takashi Hirai, Fumiko Sunaga, Mio Tajiri, Yukihiko Hirai, Takashi Shimada, Hidehiro Mizusawa, Takanori Yokota.
  • 雑誌名: Mol Pain. 巻: 9 ページ: 36-45
  • DOI: 10.1186/1744-8069-9-36
  • 査読あり
• [学会発表] Ultracentrifugation-free Chromatography-mediated Large-scale Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 1 (rAAV1) and rAAV9 from the Serum-free Culture Supernatant (2016)
  • 著者名/発表者名: Tomono, T., Hirai, Y., Okada, H., Adachi、K., Ishii, A., Shimada, T., Onodera, M., Tamaoka, A., Okada T
  • 学会等名: The 19th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy
  • 発表場所: Washington, DC, USA.
  • 年月日: 2016-05-04
  • 国際学会
• [学会発表] The large-scale purification of rAAV1 from the serum-free cultured medium by ion-exchange and gel-filtration chromatography-steps with ultracentrifugation-free technique. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tomono, T., Hirai, Y., Okada, H., Adachi, K., Chiyo, T., Ishii, A., Shimada, T., Onodera, M., Tamaoka, A., Okada T.
  • 学会等名: The 21st Annual Meeting of Japan Society of Gene Therapy
  • 発表場所: Osaka, JAPAN
  • 年月日: 2015-07-24
  • 国際学会
• [学会発表] Gene therapy to rescue lethal hypophosphatasia model mice by adeno-associated virus-mediated muscle transduction of bone-targeted alkaline phosphatase. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakamura-Takahashi,A., Miyake K., Watanabe, A., Hirai, Y., Miyake, N., Iijima, O., Adachi K., Kinoshita, H., Noguchi, T., Abe, S.,Shimada, T.,Okada, T.
  • 学会等名: The 21st Annual Meeting of Japan Society of Gene Therapy
  • 発表場所: Osaka, JAPAN
  • 年月日: 2015-07-24
  • 国際学会
• [学会発表] Efficient Scalable Purification of rAAV1 Using Ion-Exchange and Gel-Filtration Chromatography To Avoid Ultracentrifugation Procedure. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tomono, T., Hirai, Y., Okada, H., Chiyo, T., Shimada, T., Onodera, M.., Okada T.
  • 学会等名: The 18th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy
  • 発表場所: New Orleans, Louisiana, USA.
  • 年月日: 2015-05-13
  • 国際学会
• [学会発表] Prolonged Survival and Improved Phenotypes of Lethal Hypophosphatasia Model Mice by Adeno-Associated Virus-Mediated Muscle Transduction of Bone-Targeted Alkaline Phosphatase. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakamura-Takahashi,A., Miyake K., Watanabe, A., Hirai, Y., Miyake, N., Iijima, O., Adachi K., Kinoshita, H., Noguchi, T., Abe, S., Shimada, T., Okada, T.
  • 学会等名: The 18th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy
  • 発表場所: New Orleans, Louisiana, USA.
  • 年月日: 2015-05-13
  • 国際学会
• [学会発表] Tyrosine-mutated AAV2 mediated BDNF rescued inner retina in rat retinal ischemic injury mode. (2015)
  • 著者名/発表者名: Igarash T, Miyake K, Kobayashi M, Miyake N, Iijima O, Nakamoto K, Hirai Y, Shimada T, Okada T, Takahashi T.
  • 学会等名: The Association for Research in Vision and Ophthalmology, Inc. (ARVO) Asia-ARVO 2015
  • 発表場所: Yokohama, Japan
  • 年月日: 2015-02-16 – 2015-02-19
• [学会発表] Rescue of lethal hypophosphatasia model mice by adeno-associated virus mediated muscle specific expression of bone targeted alkaline phosphatase. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakamura A, Iijima O, Miyake K, Watanabe A, Hirai Y, Kinoshita H, Noguchi T, Abe S, Okada T, Shimada T.
  • 学会等名: The 64th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics
  • 発表場所: San Diego, California,USA
  • 年月日: 2014-10-18 – 2014-10-22
• [学会発表] Tyrosine-mutated AAV2 mediated BDNF rescued inner retina in rat retinal ischemic injury model (2014)
  • 著者名/発表者名: Igarashi T, Miyake K., Kobayashi M, Takahashi K., Miyake N., lijima 0., Nakamoto K., Hirai Y, Shimada T, Okada T, Takahashi H
  • 学会等名: The 20th Annual Meeting of Japan Society of Gene Therapy (JSGT2014)
  • 発表場所: Tokyo, JAPAN
  • 年月日: 2014-08-06 – 2014-08-08
• [学会発表] Production and purification of AAV1 and AAV9 vectors without using ultracentrifugation (2014)
  • 著者名/発表者名: Tomono T, Hirai Y., Shimada T., Onodera M., Okada T.
  • 学会等名: The 20th Annual Meeting of Japan Society of Gene Therapy (JSGT2014)
  • 発表場所: Tokyo, JAPAN
  • 年月日: 2014-08-06 – 2014-08-08
• [学会発表] Improvement of hypophosphatasia model mice by muscle specific expression of bone targeted alkaline phosphatase using self-complementary AAV8 vector. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakarmura A, Iijima 0, Miyake K., Watanabe A., Hirai Y, Kinoshita H, Noguchi T, Abe S., Okada T, Shimada T
  • 学会等名: The 20th Annual Meeting of Japan Society of Gene Therapy (JSGT2014)
  • 発表場所: Tokyo, JAPAN
  • 年月日: 2014-08-06 – 2014-08-08
• [学会発表] Long-term enzyme supplementation into the CSF to treat metachromatic leukodystrophy by intraventricular injection of AAV1 vector (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki Y., Hironaka K, Miyake N., Hirai Y., Miyake K., Okada T., Shimada T.
  • 学会等名: The 20th Annual Meeting of Japan Society of Gene Therapy (JSGT2014)
  • 発表場所: Tokyo, JAPAN
  • 年月日: 2014-08-06 – 2014-08-08
• [学会発表] Efficient Protection of Retina By Tyrosine-Mutated Self-Complementary AAV2 Vector Encoding BDNF in a Rat Retinal Ischemic Injury Model (2014)
  • 著者名/発表者名: Igarashi T, Miyake K, Kobayashi, Takahashi K, Miyake N, Iijima O, Nakamoto K, Hirai Y, Shimada T, Takahashi H.
  • 学会等名: The 17th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy
  • 発表場所: Washington, DC、USA
  • 年月日: 2014-05-21 – 2014-05-24
• [学会発表] Targeted Gene Transfer into the Ependymal Cells and Long－Term Enzyme Replacement in the CSF by Intraventricular Injection of AAV Vector Serotype 1 (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshiyuki Yamazaki, Kohei Hironaka, Yukihiko Hirai, Koichi Miyake, Takashi Shimada
  • 学会等名: The American Society of Gene & Cell Therapy
  • 発表場所: Salt Lake City, Utah, USA .