進化分子工学を基盤とする新規な「抗体様」臨床検査薬の創製と応用

• 研究課題/領域番号: 25460709
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 病態検査学
• 研究機関: 神戸薬科大学
• 研究代表者: 森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 助手 (20299085)
• 研究分担者: 小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477) ; 大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 助教 (80572966)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円); 2015年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円); 2014年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円); 2013年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
• キーワード: 進化分子工学

研究成果の概要

抗体は、各種臨床検査に重用されているが、その結合部位はVHとVLの2つのドメインの間に構築される上、大腸菌内での発現量も低いため、遺伝子操作により機能を改変するうえで障害が大きい。そこで、分子量が小さく、標的分子の結合部位を単一のドメイン内に持ち、大腸菌内で高い発現率が得られる、新しい「抗体様」タンパク質の創製を試みた。ビオチン結合タンパク質であるストレプトアビジン (stav) の単量体に着目し、進化分子工学の手法によりランダム変異をもつループ構造を導入してstav変異体の分子集団 (ライブラリー) を作製し、エストラジオールに特異的な結合能を示す分子種を得ることができた。

研究成果

• [雑誌論文] Gaussia Luciferase as a Genetic Fusion Partner with Antibody Fragments for Sensitive Immunoassay Monitoring of Clinical Biomarkers (2015)
  • 著者名/発表者名: Oyama Hiroyuki; Morita Izumi; Kiguchi Yuki; Miyake Sayaka; Moriuchi Ayaka; Akisada Tatsuki; Kobayashi Norihiro; Niwa Toshifumi
  • 雑誌名: Analytical chemistry 巻: 87(24) 号: 24 ページ: 12387-12395
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.5b04015
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two chalcones, 4-hydroxyderricin and xanthoangelol, stimulate GLUT4-dependent glucose uptake through the LKB1/AMP-activated protein kinase signaling pathway in 3T3-L1 adipocytes (2015)
  • 著者名/発表者名: Ohta, Mitsuhiro; Fujinami, Aya; Kobayashi, Norihiro; Amano, Akiko; Ishigami, Akihito; Tokuda, Harukuni; Suzuki, Nobutaka; Ito, Fumitake; Mori, Taisuke; Sawada, Morio;
  • 雑誌名: Nutrition Research 巻: 35(7) 号: 7 ページ: 618-625
  • DOI: 10.1016/j.nutres.2015.05.010
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cellular Interaction and Cytotoxicity of the Iowa Mutation of Apolipoprotein A-I (ApoA-IIowa) Amyloid Mediated by Sulfate Moieties of Heparan Sulfate (2015)
  • 著者名/発表者名: Kuwabara, K., Nishitsuji, K., Uchimura, K., Hung, S.C., Mizuguchi, M., Nakajima, H., Mikawa, S., Kobayashi, N., Saito, H., and Sakashita, N.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 290 号: 40 ページ: 24210-24221
  • DOI: 10.1074/jbc.m115.652545
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Direct detection of ABCA1-dependent HDL formation based on lipidation-induced hydrophobicity change in apoA-I. (2014)
  • 著者名/発表者名: Risa Omura, Kohjiro Nagao, Norihiro Kobayashi, Kazumitsu Ueda, and Hiroyuki Saito
  • 雑誌名: J Lipid Res. 巻: 55 号: 11 ページ: 2423-2431
  • DOI: 10.1194/jlr.d049445
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Anti-idiotype scFv-enzyme fusion proteins: A clonable analyte-mimicking probe for standardized immunoassays targeting small biomarkers. (2013)
  • 著者名/発表者名: Oyama H., Tanaka E., Kawanaka T., Morita I., Niwa T., Kobayashi N.
  • 雑誌名: Analytical Chemistry 巻: 85 号: 23 ページ: 11553-11559
  • DOI: 10.1021/ac402868f
  • 査読あり
• [雑誌論文] “Breeding” diagnostic antibodies for higher assay performance: a 250-fold affinity-matured antibody mutant targeting a small biomarker. (2013)
  • 著者名/発表者名: Oyama H., Yamaguchi S., Nakata S., Niwa T., Kobayashi N.
  • 雑誌名: Analytical Chemistry 巻: 85 号: 10 ページ: 4930-4937
  • DOI: 10.1021/ac3037602
  • 査読あり
• [学会発表] オンサイト分析を目的とする Teoc 化覚せいアミンに対するモノクローナル抗体の作製 (2016)
  • 著者名/発表者名: 黒田 裕美, 森田 いずみ, 伊藤 綾, 小山 千尋, 池田 夏美, 大山 浩之, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-03-28
• [学会発表] 抗エストラジオールscFv 試験管内親和性成熟機構の解析（2） (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本 知佳, 大山 浩之, 木口 裕貴, 森田 いずみ, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-03-28
• [学会発表] 高性能変異抗体の効率的単離を目的とする抗ファージ scFv-GLuc 融合体の調製 (2016)
  • 著者名/発表者名: 木口 裕貴, 藤田 真聡, 片山 恵美子, 大山 浩之, 森田 いずみ, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-03-28
• [学会発表] 抗コルチゾールscFv の親和性成熟における部位特異的点変異の効果 (2016)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之, 徳重 仁美, 知念 絵美理, 森下 知美, 森田 いずみ, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第136年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-03-28
• [学会発表] 試験管内親和性成熟による実用抗体の創製：低分子バイオマーカーを例に (2015)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之
  • 学会等名: 生物化学的測定研究会第20回学術シンポジウム
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-11-13
  • 招待講演
• [学会発表] 高親和力抗エストラジオール変異scFvの創製とその親和性成熟機構の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，江浪 友理，田川 達矢，山本 知佳，森田 いずみ，小林 典裕
  • 学会等名: 第55回日本臨床化学会年次学術集会
  • 発表場所: 吹田
  • 年月日: 2015-10-31
• [学会発表] 改良型抗エストラジオールscFvの親和性成熟機構の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，江浪 友理， 田川 達矢，山本 知佳，森田 いずみ，小林 典裕
  • 学会等名: 日本分析化学会第64年会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2015-09-11
• [学会発表] scFv－ルシフェラーゼ融合タンパク質を用いるチロキシン生物発光ELISAの試み (2015)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，宮下 貴之，森田 いずみ，小林 典裕
  • 学会等名: 日本分析化学会第64年会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2015-09-11
• [学会発表] Sensitive luminescent ELISA for human serum cortisol using a fusion protein combining anti-cortisol scFv and Gaussia lusiferase (2015)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Oyama, Norihiro Kobayashi
  • 学会等名: European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • 発表場所: paris
  • 年月日: 2015-06-22
  • 国際学会
• [学会発表] "Antibody breeding" for more sensitive immunoassays 1: Three-step affinity maturarion generated an improved scFv suitable for serum estradiol-17 beta ELISA (2015)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Oyama, Norihiro Kobayashi
  • 学会等名: European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • 発表場所: paris
  • 年月日: 2015-06-22
  • 国際学会
• [学会発表] "Antibody breeding" for more sensitive immunoassays 2: Human urinary cotinine ELISA using an affinity matured scFv to monitor tabacco smoke exposure (2015)
  • 著者名/発表者名: Izumi Morita, Hiroyuki Oyama, Norihiro Kobayashi
  • 学会等名: European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • 発表場所: paris
  • 年月日: 2015-06-22
  • 国際学会
• [学会発表] 抗コチニン scFv の親和性成熟における部位特異的点変異の効果 (2015)
  • 著者名/発表者名: 森田 いずみ, 西村 沙貴, 蓑田 早耶香, 木口 裕貴, 大山 浩之, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-03-27
• [学会発表] 大麻成分に対するモノクローナル抗体の調製とキャラクタリゼーション (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 綾, 安尾 まゆみ, 竜田 都加, 森田 いずみ, 大山 浩之, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-03-27
• [学会発表] 抗エストラジオール scFv 試験管内親和性成熟機構の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之, 江浪 友理, 木口 裕貴, 森田 いずみ, 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-03-27
• [学会発表] 改良型変異scFvフラグメントを用いるヒト尿中コチニンのモノクローナルELISA (2014)
  • 著者名/発表者名: 森田いずみ、平井杏奈、西村沙貴、大山浩之、太田光煕、小林典裕
  • 学会等名: 日本分析化学会第63年会
  • 発表場所: 東広島
  • 年月日: 2014-09-18
• [学会発表] 抗チロキシン一本鎖 Fvフラグメントの創製と諸性質 (2014)
  • 著者名/発表者名: 森田 いずみ，寺澤 清伽，泉 亜紀，宮岡 広子，大山 浩之，小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第１３４年会
  • 発表場所: 熊本
• [学会発表] 実用診断試薬を創出する試験管内分子進化 (7). 低親和力抗コルチゾール抗体の親 和性成熟 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，森下 知美，福島 咲子，安井 孝治，小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第１３４年会
  • 発表場所: 熊本
• [学会発表] scFv― ルシフェラーゼ融合タンパク質を用いるコルチゾール高感度発光 ELISA の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，三宅 沙也香，秋定 辰紀，森内 彩香，丹羽 俊文， 小林 典裕
  • 学会等名: 日本薬学会第１３４年会
  • 発表場所: 熊本
• [学会発表] ""Breeding" Diagnostic Antibodies: An Affinity-Matured scFv for Urinary Cotinine ELISA to Monitor Tobacco Smoke Exposure (2013)
  • 著者名/発表者名: Morita I., Oyama H., Banzono E., Ohta M., Kobayashi N.
  • 学会等名: Fifth Annual PEGS Europe : Protein & Antibody Engineering Summit
  • 発表場所: Lisbon
• [学会発表] 試験管内親和性成熟scFvを用いるヒト尿中コチニンのELISA (2013)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，森田 いずみ，太田 光熙，小林 典裕
  • 学会等名: 生物化学的測定研究会 第１８回学術集会・総会
  • 発表場所: 京都
• [学会発表] 高親和力scFv融合タンパク質を用いるコルチゾールの高感度ELISA (2013)
  • 著者名/発表者名: 大山 浩之，森田 いずみ，太田 光熙，小林 典裕
  • 学会等名: 第５３回日本臨床化学会年次学術集会
  • 発表場所: 徳島
• [学会発表] Anti-Idiotype scFv-Enzyme Fusion Proteins Work as a Clonable Analyte-Mimicking Probe That Enables Standardization of Hapten Immunoassays (2013)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi N., Oyama H., Morita I., Niwa T.
  • 学会等名: Fifth Annual PEGS Europe : Protein & Antibody Engineering Summit
  • 発表場所: Lisbon
• [学会発表] "Breeding" Diagnostic Antibodies: A 250-Fold Affinity-Matured scFv Mutant for Measuring Human Serum Estradiol-17β (2013)
  • 著者名/発表者名: Oyama H., Niwa T., Kobayashi N.
  • 学会等名: Fifth Annual PEGS Europe : Protein & Antibody Engineering Summit
  • 発表場所: Lisbon
• [図書] 免疫測定法 基礎から先端まで (2015)
  • 著者名/発表者名: 生物化学測定研究会 編
  • 総ページ数: 325
  • 出版者: 講談社
• [図書] 免疫測定法 (2014)
  • 著者名/発表者名: 生物化学的測定研究会編
  • 総ページ数: 323
  • 出版者: 講談社
• [備考] 神戸薬科大学 生命分析化学研究室
  • URL: http://www.kobepharma-u.ac.jp/analchem/
• [備考] 神戸薬科大学 生命分析化学研究室ホームページ
  • URL: http://www.kobepharma-u.ac.jp/analchem/