活動性の高いニューロンへの光穿孔による選択的遺伝子導入

• 研究課題/領域番号: 25640007
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 配分区分: 基金
• 研究分野: 神経生理学・神経科学一般
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 狩野 方伸 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (40185963)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2014-03-31
• 研究課題ステータス: 中途終了 (2013年度)
• 配分額: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2014年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円); 2013年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: 神経科学 / 生理学 / 脳・神経 / ニューロン / シナプス

研究概要

生きた動物個体の脳において、活動性の高い神経細胞に光を用いて自由に遺伝子導入できる技術を開発することが本研究の目的である。In vivoカルシウムイメージングによって同定された活動性の高いニューロンに、フェムト秒パルスレーザーを用いて細胞膜の光穿孔を行うことで、広い範囲（500ミクロン四方）に分布するニューロン一つ一つに独立に外来遺伝子を導入することを可能にする。これまでに、マウス個体脳において光穿孔を行うための条件検討を開始した。蛍光色素を脳内の細胞外領域に注入し、個々のニューロンの近傍で光照射を行い、細胞内に蛍光色素が取り込まれるかどうかで光穿孔を確認した。脳内の様々な深さにおいて、光穿孔に必要なレーザー強度、パルス幅、繰り返し頻度について検討を行った。皮質の表面近傍では光穿孔が可能であることは確認されたが、さらに深層のニューロンに光穿孔を行うための条件検討が必要であることが判明した。また、活動性の高いニューロンを同定するためのin vivoカルシウムイメージングの感度を向上させ、効率を高めるために、新規の高感度カルシウム感受性指示薬について、脳スライス標本およびマウス生体内でその特性を検討した。その結果、マウス生体内においても１発の活動電位で起こるカルシウム濃度変化を高いS/N比で検出するできることが確認された。さらに、活動性の高い神経細胞の活動を長期にわたって観察し、かつ、光による活動操作を行うために必要なカルシウムセンサータンパク質やチャネルロドプシンなどの分子を、光穿孔によって導入するためのプラスミドを作製した。