| 研究概要 |
これまでに他グループによって大腸菌グルコース結合タンパク質（MglB）の末端に蛍光タンパク質であるCFPとYFPを結合したFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）センサが作製されており、ヒト培養細胞を一過的に形質転換することによって細胞内グルコース濃度を定量的に計測できることが示された（Takanaga H et al, Biochim Biophys Acta, 2008, 1778, 1091）。このFRETセンサはグルコース濃度に鋭敏に反応してFRETを生じるため、細胞内でのグルコース濃度をリアルタイムに評価できる。一方、腸管上皮細胞におけるグルコース輸送担体Glut2は、細胞内グルコース濃度に応答して数分以内に発現が増減することが明らかとなっている。つまり、時間応答性の高いFRETセンサをCaco-2細胞に組み入れることにより、細胞外から取り込んだグルコース量をリアルタイムで定量できる。そこで平成25年度は、この発現ベクターを用いてグルコースセンサを安定発現するCaco-2細胞を取得することを目標とした。グルコース結合活性の異なる3種のFRETセンサをコードするpcDNA3.1 FLIPglu-3.2mDelta13V、pcDNA3.1 FLIPglu-600uDelta13V、pcDNA3.1 FLIPglu-30uDelta13Vを制限酵素によって直鎖状にしたDNAを用いて未分化のCaco-2細胞を形質転換した。G418による選抜を実施するとともに蛍光顕微鏡によって発現および局在を確認することにより、各々のFRETセンサを細胞質に安定的に発現するCaco-2細胞を単離した。現在、これらの細胞の染色体に組み入れられたFRETセンサ遺伝子のコピー数を検定するとともに、mRNA発現量の多い株を選抜している。今後、得られた安定発現株を用いてグルコース吸収評価に適用する。
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