| 研究課題/領域番号 |
25850059
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 研究分野 |
応用微生物学
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| 研究機関 | 別府大学 |
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研究代表者 |
林 毅 別府大学, 食物栄養科学部, 准教授 (40399811)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| 研究課題ステータス |
中途終了 (2015年度)
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| 配分額 *注記 |
3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
2015年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2014年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2013年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | Zymomonas mobilis / 呼吸鎖 / エタノール発酵 / プロテオーム解析 / NADH/NAD+ |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題はエタノール発酵細菌Zymomonas mobilisの呼吸鎖の呼吸以外の新規生理機能を明らかにするものである。前年度までにこの呼吸鎖が塩耐性にかかわっていることを初めて明らかにすることができた。さらにメカニズムとして、この呼吸鎖は細胞内の酸化還元バランス（NAD＋とNADHのバランス）の維持に寄与していることを証明し、論文として発表した。しかしながらここで新たな疑問が生じた。すなわちZ. mobilisはリュウゼツランという植物の蜜から単離された微生物であり海洋性微生物ではないため、NaClやKClなどの塩を含んだ環境にさらされることは、通常ではありえない。つまりこの呼吸鎖には、まだ別の重要な生理機能を有する可能性が強く示唆された。そこでこれまでの解析では電子伝達酵素（複合体Iや末端酸化酵素）を中心に解析していたが、呼吸鎖の最も重要な部分はATPを合成する（Z. mobilisの場合は分解）複合体Vであるとも考えられるため、複合体Vに関して解析を試みた。先ず複合体Vの遺伝子欠損株の取得を行うために、複合体V中で最も重要な構成因子であるベータサブユニット（ATP合成酵素サブユニット）の破壊を目指した。同時に、最近複合体Vのベータサブユニットが細胞内で比較的多くタンパク質発現しているとの報告がなされたため、二次元電気泳動により細胞内可溶性タンパク質を高精度に分離し、その中で複合体Vのベータサブユニットの特定を試みた。その結果、破壊株の取得は現在進行中であるが、二次元電気泳動のゲル上におけるベータサブユニットの同定には成功した。今後は二次元電気泳動を用いたベータサブユニットの発現プロファイルの解析と破壊株の表現型を評価することで、複合体Vの機能の解析、ひいてはZ. mobilis呼吸鎖の未知生理機能の解明を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Z. mobilis呼吸鎖経路の完全解明による未知生理機能の解明に関しては立ち遅れている。しかしながら異なる切り口で解析を進めた結果、当初の目標であったZ. mobilis呼吸鎖の未知生理機能に関して明らかにすることができた。すなわちNaClやKCl等の塩に対する耐性能の付与に関与しており、そのメカニズムとしては細胞内の酸化還元バランスの維持に関与していることを証明した。成果として、イギリスの微生物学の専門誌であるMicrobiologyに論文発表することができた。以上で概ね目標を達成出来たと思われたが、解析の過程でそれ以上に重要な生理機能の存在が強く示唆されたため、3年の研究計画を1年延長させて頂くこととした。解析の基盤技術は今年度で概ね整備できたため、最終年度で呼吸鎖の未知なる生理機能の解明を行いたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
Z. mobilisのさらなる重要な未知生理機能を明らかにするために、これまで対象としていた電子伝達酵素（複合体Iや末端酸化酵素）ではなく、呼吸鎖の最も重要な部分ともいえる複合体V（ATP合成酵素複合体）にターゲットを絞る。これまでZ. mobilisの複合体Vは通常とは逆のATPをADPへ加水分解しているという報告がある。この現象をより詳しく観察するために、先ず前年度に確立した二次元電気泳動により、複合体Vのベータサブユニット（ATP合成酵素サブユニット）のタンパク質の発現を様々な条件（例えば好気や嫌気、静置など）で解析する。さらに複合体Vの酵素活性欠損株の取得し、同時に表現型を評価する。これらのデータを元にZ. mobilis呼吸鎖の未知生理機能のための研究を展開する。
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| 次年度使用額の使用計画 |
遺伝子破壊株の作製を行うために、それに必要な酵素類（制限酵素、DNA相同組換え用酵素等）を購入したい。またプロテオーム解析を行うため、二次元電気泳動関係の消耗試薬（IPGストリップ、タンパク質抽出バッファー等）やタンパク質同定に必要なプロテインシーケンサーの消耗試薬を購入したい。
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