研究課題
基盤研究(C)
GeneBに関して、GeneBのノックダウン(KD)により、細胞接着欠失による細胞死anoikisが誘導されることを確認しているが、このGeneBとAnoikis制御との関連を解析するために、細胞表面に存在する接着分子インテグリンに注目した。インテグリンは細胞接着に直接関わり、細胞内キナーゼFAKにシグナルを伝達し、Anoikis抑制に作用する。GeneB-KDにより、細胞接着状態でもFAKリン酸化が低下し、FAK活性の低下が示唆された。またFAKシグナル下流分子のリン酸化も低下していた。これらはGeneBが機能的にインテグリンシグナルに関わり、anoikis制御において非常に重要な役割を果たしていることを示す重要な研究成果である。更に昨年度検討した、CRISPR-Cas9を用いたGeneBノックアウト(KO)の検討を、他の癌細胞株においても施行した。昨年度の結果と同様に、他の癌細胞株においても、やはり著明な増殖抑制が引き起こされ、細胞増殖制御におけるGeneBの重要な役割が示唆された。GeneAに関しては、この分子に結合する分子群の網羅的同定を目的として、Myc-tag付加したGeneA産物を発現するレンチウイルスコンストラクトを作成し、ウイルスを産生した。それを癌細胞株に感染させ、Myc-tag抗体で免疫沈降し、GeneA産物分子に結合し共沈降してくる分子を検索しており、種々実験条件を検討して実験を進めている。
2: おおむね順調に進展している
GeneBがAnoikis制御に関わる機序の解明は、本研究の重要な目的であるが、今年度の研究により、その機序としてGeneBが機能的にインテグリンシグナルに関わることを示す重要な研究成果が得られた。またCRISPR-Cas9を用いてのGeneB-KO実験も昨年度の研究成果を裏付ける結果が得られている。したがってGeneBに関する実験計画は順調に進んでいる。GeneAの機能解明のためのGeneA産物結合分子の探索に関しても、必要なコンストラクトを作成し、種々の条件を検討しながら探索的解析を進めており、GeneA結合分子の網羅的同定の計画は着実に進行している。ただ遺伝子導入されウイルスを産生する細胞内でもGeneA産物が発現し、それが強い増殖抑制作用を持つため、ウイルス産生効率が高くなく、更にウイルス産生条件を検討・調整して検討を進めている。
おおむね順調に研究計画を遂行しており、大きな変更点は無く、当初の研究計画に基づき研究を進めていく。ノックダウン・ノックアウト等による機能抑制実験により、GeneA及びGeneBの機能を更に解析すると共に、その際の細胞接着制御・anoikis制御に関わる種々のシグナル活性の変化を検討していく。また、質量分析計を用いた解析を進め、GeneA及びGeneB遺伝子産物に結合する蛋白分子群の網羅的同定を進める。それら結合分子群の内で重要なシグナル伝達分子を見出し、そのシグナル伝達分子とGeneA及びGeneB遺伝子産物との間の機能的相互作用を探索していく。
次年度使用額が生じたことにより、結合蛋白分子群の網羅的同定のため質量分析解析を予定よりも余裕を持って行なえることになった。質量分析解析の中で最適と考えられる解析法をいくつか選択し研究計画を進めていく。
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