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精細管再構成によるin vitro精子形成法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 26713049
研究種目

若手研究(A)

配分区分一部基金
研究分野 泌尿器科学
研究機関大阪大学

研究代表者

奥田 英伸  大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD) (00625452)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
研究課題ステータス 採択後辞退 (2016年度)
配分額 *注記
5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
2015年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2014年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
キーワードSertoli-like cells / レンチウイルス / Germline stem cells / 精子形成 / セルトリ細胞 / 遺伝子導入
研究実績の概要

1.Germline stem cell及びieSC(induced embryonic Sertoli cells)、MSC (Mesenchymal Stem cells)の樹立:C57BL6/Tg14(act-EGFP-OsbY01)を購入し、DBA/1Jマウスと交配させ、第一世代のmale pup(日齢1-3)の精巣よりGFP発現GS細胞株を樹立した。MEF(マウス胎児由来繊維芽細胞)を交配後13.5日の妊娠マウス(CBA/J)より樹立し、ieSC作成に不可欠な5因子の遺伝子群(Wt1, Dmrt1, Nr5a, Gata4, Sox9)をレンチウイルス感染により導入した。その後ピューロマイシンによる薬剤選択を行ったのち、クローニングを行った。24 colonyを取り、それぞれの導入遺伝子の発現を確認した。導入遺伝子の発現レベルは個々により非常に大きな差が見られた。その中で比較的発現の高いコロニーを3つ選び出した。これらは非常に高い増殖能を持ち、GDNFとFGFもMEFに比べて亢進しているという点でembryonic Sertoli cellの特長に類似していた。またadultマウスの側腹部の脂肪組織よりMSCを分離・培養を行った。
2.ieSCとGS細胞の共培養:GS細胞の培養にはFeeder cellとFGFとGDNFの添加が必須である。FGF・GDNFの発現をしているieSCをfeederとして培養が可能かどうかを検討した。ieSCをfeederとしてサイトカインなしでGS細胞と共培養を行った。通常GS細胞は増殖をすることができず死滅するが、ieSCをfeederとして使用すると、増殖までは認めなかったが、GS細胞の維持期間がやや延長した。
3.ieSCsを中心としたin vitroの精細管再構成の検討:Satoらが構築したin vitroの精細管再構成法を参考にして、アガロース上にてieSC、MSC、GS細胞の混合したものを培養した。様々な培養条件を検討したが、明らかな精細管の再構成は認められなかった。またGFPを発現するGS細胞も維持できていないことが分かった。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

27年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2015 実績報告書
  • 2014 実績報告書
  • 研究成果

    (3件)

すべて 2015

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (1件) (うち国際学会 1件)

  • [雑誌論文] A novel transcriptional factor nkapl is a germ cell-specific suppressor of notch signaling and is indispensable for spermatogenesis.2015

    • 著者名/発表者名
      Okuda, H., Kiuchi, H., Takao, T., Miyagawa, Y., Tsujimura, A., Nonomura, N., Miyata, H., Okabe, M., Ikawa, M., Kawakami, Y., et al.
    • 雑誌名

      PLoS ONE

      巻: 4 号: 4 ページ: e0124293-e0124293

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0124293

    • NAID

      120006957411

    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] LRGUK-1 is required for basal body and manchette function during spermatogenesis and male fertility.2015

    • 著者名/発表者名
      2.Liu Y, DeBoer K, de Kretser DM, O’Donnel L, O’Connor AE, Merriner DJ, Okuda, H, Whittle B, Jans D, Efthymiadis A, MacLachlan RI, Ormandy CJ, Goodnow CC, Jamsai D, O’Bryan MK
    • 雑誌名

      PLoS Genetics

      巻: 11(3) 号: 3 ページ: e1005090-e1005090

    • DOI

      10.1371/journal.pgen.1005090

    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] “A novel transcription factor NKAPL is a germ cell-specific suppressor of the Notch signaling pathway and is indispensable for spermatogenesis”2015

    • 著者名/発表者名
      Hidenobu Okuda
    • 学会等名
      The Annual scientific meeting of the Society for the Reproductive Biology in Adelaide
    • 発表場所
      Adelaide(Australia)
    • 年月日
      2015-08-22
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 国際学会

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公開日: 2014-04-04   更新日: 2017-01-06  

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