| 研究課題/領域番号 |
26860282
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
佐藤 慶治 千葉大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (00554586)
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| 研究期間 (年度) |
2014 – 2015
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| 研究課題ステータス |
中途終了 (2015年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2015年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2014年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
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| キーワード | タンパク質分解 |
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| 研究実績の概要 |
サルモネラのAAA+プロテアーゼClpXPがファゴソーム内で分解している基質候補の探索を目的として、これまでに申請者は、基質の分解を途中で停止させ基質をトラップする系を構築し、トラップした基質サンプルを質量分析にかけ、256の基質候補を得ている。この中で、ファゴソーム条件下で機能すると考えられている転写因子・グローバルレギュレーターを5件(SsrB、PmrD、IscR、Re1A、AcnB)、細胞分裂に関わる3つの候補(ZapC、Bo1A、SeqA)を選び、Hisタグ融合タンパク質発現系を構築した。これらの候補について、野生株とclpX欠損株における細胞内蓄積を比較したところ、PmrDとZapCについて、clpX欠損株における細胞内蓄積が見られた。さらに、タンパク質合成阻害剤を用いて、細胞内でのタンパク質安定性の変化を検討した結果、clpX欠損株においてPmrD及びZapCは安定化することを明らかにした。以降、2つの候補のうち、PmrDに着目して研究を進めた。PmrDは、サルモネラ菌体内でClpXPによって分解制御されていると考えられたため、次にin vitro分解実験の系を構築して、PmrDがClpXPによって直接分解されるかどうかの検討を行った。まず、Hisタグ融合PmrDの精製条件の検討を行い、90%以上の純度での精製条件を確立した。また、ここで得られた精製PmrDを用いて抗PmrD抗体を作成した。現在報告されている幾つかの基質分解条件で分解実験を行ったが、ClpXPによるPmrD分解はin vitroでは起こらなかった。CLpXPの基質の中には、アダプター因子と呼ばれる第3の因子と結合することで、自身の分解速度が大幅に上昇するケースが多数報告されている。PmrDについても、細胞内での安定性実験の結果と、in vitroの系での結果が食い違う理由として、細胞内でPmrDに結合してPmrD分解速度と量を調節する第3の因子の存在が考えられた。また、PmrDはLPS modificationと胆汁酸への感受性に関係することが知られているが、clpX欠損株は胆汁酸に対して感受性となることも明らかにしている。
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