| 研究課題/領域番号 |
57880034
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| 研究種目 |
試験研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
分子遺伝学・分子生理学
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| 研究機関 | 東京大学
岡崎国立共同研究機構 |
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研究代表者 |
三川 隆 岡山国立共同研究機構, その他 (50143417)
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| 研究期間 (年度) |
1982 – 1985
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| 研究課題ステータス |
完了 (1985年度)
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| 配分額 *注記 |
5,400千円 (直接経費: 5,400千円)
1983年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1982年度: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
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| キーワード | カルシウム結合タンパク / アフィニティ分析 / ウエスタンブロット |
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| 研究概要 |
これまで任意に単離されるのを待たねばならなかった【Ca^(2+)】交容蛋白に関し、一般に細胞の全構成蛋白から【Ca^(2+)】受容蛋白を選択検出する為の1次スクリーニング法の開発が本研究の目的である。
細胞の全蛋白をSDS-ゲル電気泳動、あるいは等電点電気泳動を組合せた2次元電気泳動により高分解能で分離展開した。分解能を維持したまま電気泳動的にアクリルアミドゲル中の蛋白をニトロセルロース膜に転写した。蛋白を転写した膜を【^(45)Ca^(2+)】(〜【pc^(-6)】M)を含む後術液と反応させ洗浄後、乾燥しオートラジオグラフをおこなった。 オートラジオグラフと膜をアミドブラックで蛋白染色したものの対応から【^(45)Ca^(2+)】結合蛋白を検出した。全行程に1日で2日月にオートラジオグラフを手にすることができる。 本方法において【10^5】【M^(-1)】以上の【Ca^(2+)】結合能を有するペプチドがオートラジオグラフで検出できることがわかった。SDS処理後も【Ca^(2+)】結合能は維持あるいは回復する場合が多いことがわかった。電気泳動したゲルを用いて【^(45)Ca^4】との反応をおこなわずニトロセルロース膜に転写することによって【^(45)Ca^(2+)】との結合・洗浄が迅速におこなえ、オートラジオグラフの為の乾燥も極短時間でおこなえ、反応中に分解能を維持できることになった。
本方法を用いることにより各種動物の多様な組織の【Ca^(2+)】結合蛋白の検出を試みた。その結果トロポニン・C、カルモジェリンといった従来より同定されている【Ca^(2+)】結合蛋白以外に多種の【Ca^(2+)】結合能を示す蛋白が検出された。特に膜分画にも【Ca^(2+)】結合蛋白が検出できることがわかり、軟体動物一般に存在する分子量20万のペプチドが【Ca^(2+)】結合能を持ち、SDS-存在下にも大きく構造変化を示すことを明らかにした。本方法で検出された新しい【Ca^(2+)】結合蛋白群に関し、単離を試みその存在様式および機能について検討を進めている。
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