| 研究概要 |
エストロゲンレセプターの精製をブタの子宮を用いて試みた。活性のあるレセプターの精製は困難であるため、〔【^3H】〕Tamoxifen agiridineでアフィニティーラベルをした、E2結合ドメインの精製を行なう事とした。ブタ子宮のサイトソルを硫安25%飽和で沈殿し、この分画について、〔【^3H】〕-Tamoxifen agiridineによってアフィニティラベルを行なった。これをアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーを取ると、66Kと50K、及び35K付近にバンドが見られ、これらのバンドはラベルしていないエストラジオールやDESによって消失するので、エストロゲンレセプターを示しているものと考えられる。なおこれらのバンドに一致して、エストロゲンレセプターに対するモノクローナル抗体が結合する(Western blot)。このTamoxifenレセプター複合体をトリプシンで処理すると、濃度の上昇と共に35K、19Kの2つの段階を経て<10Kのフラグメントに分解する。又、パパインで処理すると、66Kのバンドが27Kのバンドを経て分解していく。パパインによる27Kのバンドは比較的安定な消化段階と考えられたので、この部分を以下のHPLCにかけた。即ち先ずTSKG3,000のゲルろ過カラムにかけるとこの段階で約30倍の精製が得られた。この回収率はほぼ、100%である。次に、LS120Tの逆層クロマトグラフィーにかけると、10倍強の精製が得られた。この回収率は約10%であった。アフィニティーラベルの分画が既に50倍程度の濃縮状態にあるので、これらの段階を始めから逐次行なうことにより、約15,000倍の精製が達成される筈である。現在、大量の子宮から出発してこの方法による精製を試みつつあるが、最終標品は20%程度の純度になる予定であるので、これを更にトリプシン又はBrCNなどで分解して、生ずるペプチドをHPLCで精製し、エストロゲン結合ドメインのアミノ酸配列を決定することが出来ると考えている。
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