|
アミノ酸配列にしたがって遺伝子を設計するために、いくつかの条件の検討を行った。アミノ酸コドンのうち大腸菌において高頻度に発現している遺伝子とその産物である蛋白質のアミノ酸配列を比較すると使用コドンに対応する転移RNAの量と相関があることがわかっている。したがって高頻に使用されているコドンを用いることは宿主にとって負担が少いと考えられる。しかしヒトの遺伝子において使用されているコドンからなる相補的DNAを用いても大腸菌において効率よく発現される例がいくつか知られるようになった。発現効率には mRNAの高次構造がより大きく関与すると推定されるので、調節遺伝子とくにリボソーム結合部位(shine-Dalgarno配列、S.D.)をコードする部位と構造遺伝子のN末端領域が高次構造をとらないことが重要であると考えられる。設計した遺伝子について構造遺伝子部位ばかりではなく、上流調節部位とのインバートリピートを検出するようにプログラムを設定した。
遺伝子産物の変異体を得るために遺伝子の改変を行う必要があるので制限酵素切断配列をアミノ酸コドンを変換することによって設定した。6塩基認識の制限酵素の切断配列を設ける場合には2個のアミノ酸のコドンまたは3個のアミノ酸コドンに亘って可能となる場合がある。これらの可能なアミノ酸配列を検索するプログラムを使用可能な制限酵素について作成した。とくに使用ベクター中に対応する切断配列が存在しないことを確めた。また酵素の入手が容易であるものを選択した。
次にDNAリガーゼによる合成遺伝子切断の結合の際に副産物の生成を防ぐために繰返し配列が100塩基以内に存在しないようにコドンの選択を行った。とくに自己相補的配列が合成フラグメントの末端にないように区切った。
|
