| 研究課題/領域番号 |
60224009
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| 研究種目 |
特定研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
大野 典也 東京慈恵会医科大学, 医, 教授 (60147288)
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| 研究期間 (年度) |
1985
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| 研究課題ステータス |
完了 (1985年度)
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| 配分額 *注記 |
1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1985年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | Qβレプリカーゼ / 鋳型特異性 / RNAファージMX-1 |
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| 研究概要 |
〔研究目的〕 RNAファージ感染菌中のレプリカーゼ(RNA依存RNA合成酵素)は、高い鋳型特異性を有するRNA合成酵素である。この酵素蛋白とRNA分子との相互認識の機構の解明は単にRNAファージの発生と進化の理解に役立つのみでなく、普遍的な核酸と蛋白質との相互識別の機構の理解さらには生命体の持つ分子認識機構の理解のためにも極めて重要な問題である。
〔研究成果〕(1)Qβレプリカーゼの分離、50gのRNAQβの感染菌に(-80℃凍結保存)と100gのアルミナを徐々に加えながら菌を破砕する。これに300mlの緩衝液を加えて懸濁液としてこれを10,000rpm10分間遠心する。沈査に50%polyethylen glycolと30%(w/w)Dextran 500を加えて30分間撹拌する。これを遠心してDextran層を集める。これをNaClを含む緩衝液に溶す。さらにPolyethylen glycolを加えて、のち遠心する。Polyethylenglycol層にレプリカーゼは分画されて来る。これを透析したのち55%飽和硫安を加える。遠心して沈査を集めこれをカラムクロマトの原材料とする。2.フォスフォ・セルロース・カラム(PC) フォスフォ・セルロース・カラムにphase分配によって得られた試料をのせ50mM-1M NaClの濃度勾配によって溶出する。酵素活性をAssayして活性分画を集める。3.QAESephadexクロマトグラフ PCカラムよりの活性分画をQAE Sephadexカラムにのせ100mM AmS-300mM AmSの直線濃度勾配によって溶出する。4.アガロース・ゲル濾過 Bio Gel A0.5mカラムによってゲル濾過することによってきわめて高い比活性のQβレプリカーゼ 分離に成功した。 (2)Mx-1レプリカーゼの分離、Mx-1レプリカーゼ分離の為の第一段階として目下各種の分離条件を検討中である。Qβに於いて成功した方法についてまず試みるべく目下その準備を進めている。
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