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酵素機能の動的解析

研究課題

研究課題/領域番号 60430027
研究種目

一般研究(A)

配分区分補助金
研究分野 応用生物化学・栄養化学
研究機関京都大学

研究代表者

廣海 啓太郎  京都大学, 農学部, 教授 (50025425)

研究分担者 赤坂 一之  京都大学, 理学部, 助教授 (50025368)
中谷 博  京都大学, 農学部, 助手 (00026577)
大西 正健  京都大学, 農学部, 助手 (90026576)
外村 辨一郎  京都大学, 農学部, 助教授 (20026545)
研究期間 (年度) 1985 – 1988
研究課題ステータス 完了 (1988年度)
配分額 *注記
23,200千円 (直接経費: 23,200千円)
1988年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1987年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1986年度: 5,000千円 (直接経費: 5,000千円)
1985年度: 15,200千円 (直接経費: 15,200千円)
キーワードプロテアーゼ / アミノアミルtRNA合成酵素 / アミラーゼ / プロテアーゼインヒビター / 酵素一基質相互作用 / 蛍光滴定 / ストップトフロー / 核磁気共鳴 / アミノアシルtRNA合成酵素 / 酵素ー基質相互作用 / 核磁気共鳴法 / 蛍光滴定法 / 化学修飾 / 酵素-基質相互作用 / 誘導適合 / 酵素 / グルコアミラーゼ / 基質特異性 / 蛋白質蛍光 / プロテアーゼ・インヒビター / ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター(SSI)
研究概要

本研究は、酵素機能のうち基質に対する分子認識に焦点を絞り、吸収、蛍光、核磁気共鳴などの分光学的な手法を用いて、平衡論的及び速度論的に観測し、解析しようとするもので、約10種の酵素について、ほぼ満足すべき成果を挙げることができた。また、従来のものよりはるかに少ない試料量で、しかも同程度の性能を有するミクロストップトフロー装置の試作及び迅速な熱交換器を用いることにより、大巾な温度の上昇と下降の可能な温度ジャンプ装置の開発など、新しい方法論の開発に成功し、それぞれ幾種かの酵素について、その有用性を実証することができた。一方、速やかな化学修飾法の速度論的解析から、酵素活性部位のトリプトファン残基の存在状態とその役割を探究する方法を確立することができた。さらに、核磁気共鳴法により、蛋白質分子の"ゆらぎ"を探ると共に、これを目印として酵素と基質やアナログとの相互作用を究明するといった、動的な解析法も新たに確立した。酵素と基質または基質アナログとの相互作用は、両者の結合が一段階で生じるのでなく、まず、緩く結合した中間複合体を形成し、続いて特異的に強く結合した最終的な複合体が生じる、少なくとも二段階の機構が普遍的であることが、高速反応速度論的解析によって明らかとなった。この第二段階の一分子過程において、酵素分子の内部運動(ゆらぎ)が重要な役割を演じるものと考えられた。本研究を通して、酵素機能の動的な解析に関する戦略としては、微視的構造知見を得る諸方法の時間分解の向上が最も有効であり、X線回折、吸収と散乱の観測、磁気共鳴、振動スペクトルの時間分解は、各手法の適応対象について既に試みられつつある。また、分子運動や反応速度を低下させることにより、時間分割を容易にしようとする低温化学とか蛋白質工学の手法を活用するのが、今後、さらに有用な手段になっていくものと考えられる。

報告書

(5件)
  • 1988 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1987 実績報告書
  • 1986 実績報告書
  • 1985 実績報告書
  • 研究成果

    (92件)

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  • [文献書誌] 廣海啓太郎: 澱粉科学. 32. 84-93 (1985)

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  • [文献書誌] 廣海啓太郎: 蛋白質、核酸、酵素. 28. 32-36 (1985)

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  • [文献書誌] 中谷博: 蛋白質、核酸、酵素. 28. 200-203 (1985)

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  • [文献書誌] 中谷博: 蛋白質、核酸、酵素. 28. 321-323 (1985)

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  • [文献書誌] 大西正健: 澱粉科学. 34. 58-65 (1987)

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  • [文献書誌] 廣海啓太郎: 日本農芸化学会誌. 62. 1805-1810 (1988)

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  • [文献書誌] 外村辨一郎: 日本農芸化学会誌. 62. 1814-1817 (1988)

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  • [文献書誌] 赤坂一之: 日本農芸化学会誌. 62. 1818-1822 (1988)

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  • [文献書誌] Nakatani,H.: Anal.Biochem.149. 89-90 (1985)

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  • [文献書誌] Nakatani,H.: Biochemistry. 25. 3515-3518 (1986)

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  • [文献書誌] Ohnishi,M.: Jap.J.Clin.Chem.14. 253-259 (1985)

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  • [文献書誌] Ohnishi,M.: Anal.Sci.1. 89-90 (1985)

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  • [文献書誌] Igushi,T.: Makromol.Chem.,Rapid Commun.7. 497-503 (1986)

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  • [文献書誌] Kitagishi,K.: Agric.Biol.Chem.50. 1113-1116 (1986)

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  • [文献書誌] Kakitani,M.: Agric.Biol.Chem.50. 2437-2444 (1986)

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  • [文献書誌] Kitagishi,K.: J.Biochem.99. 191-197 (1986)

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  • [文献書誌] Tanaka,A.: J.Biochem.100. 1379-1385 (1986)

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  • [文献書誌] Kakitani,M.: J.Biochem.101. 477-484 (1987)

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  • [文献書誌] Ohnishi,M.: Carbohydr.Res.165. 155-160 (1987)

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  • [文献書誌] Kakitani,M.: Biochem.Internatl.14. 597-603 (1987)

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  • [文献書誌] Kanaya,K.: Agric,Biol.Chem.51. 1885-1892 (1987)

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  • [文献書誌] Kanaya,K.: Agric.Biol.Chem.52. 2615-2616 (1988)

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  • [文献書誌] Kanaya,K.: Agric.Biol.Chem.52. 2563-2568 (1988)

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  • [文献書誌] Kitagishi,K.: J.Biochem.103. 585-588 (1988)

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  • [文献書誌] Nakatani,H.: Arch.Biochem.Biophys.263. 311-314 (1988)

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  • [文献書誌] Akasaka,K.: Proteins:structure,function and genetics. 4. 131-136 (1988)

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  • [文献書誌] Akasaka,K.: Can.J.Chem.66. 2014-2017 (1988)

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  • [文献書誌] Kakitani,M.: Biochim.Biophys.Acta. (1989)

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  • [文献書誌] Hiromi,K.: "Protein protease inhibitor-The case of Streptomyces subtilisin inhibitor(SSI)" Elsevier, 481 (1985)

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  • [文献書誌] 廣海啓太郎: "酵素II(酵素反応の新しい研究法)" 朝倉書店, 187 (1985)

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  • [文献書誌] 中村道徳: "アミラーゼー生物工学へのアプローチ" 学会出版センター, 374 (1986)

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  • [文献書誌] 大西正健: "酵素反応速度論実験入門" 学会出版センター, 218 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hiromi,K.: "Handbook of amylases and related enzymes" Pergamon Press, 274 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakatani, H.: "Construction of up-and-down temperatur-jump apparatus." Anal. Biochem.149. 89-90 (1985)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kitagishi, K.: "pH-jump of pepsin studied by tyrosine ionization." Agric. Biol. Chem.50. 1113-1116 (1986)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi, M.: "Characterization, by the binding of D-mannonolactone, of the subsites adjacent to the catalytic site of glucoamylase from Rhizopus niveus." Carbohydr. Res.165. 155-160 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Akasaka, K.: "Proton spin-lattice relaxation in a solid protein Streptomyces subtilisin inhibitor. Enhancement of segmental motions by adsorbed water." Can. J. Chem.66. 2014-2017 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kakitani, M.: "Static and kinetic studies on binding of a fluorescent analogue of ATP and valyl-tRNA synthetase from Bacillus stearothermophilus." Biochim. Biophys. Acta. (1989)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakatani, H.: "Enthalpy and heat capacity changes to formation of compound I with horseradish peroxidase and complexes with benzhydroxamic acid and benzhydrazide." Biochemistry. 25. 3515-3518 (1986)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi, M.: "The continuous auto-analyzer for amylase activity." Jap. J. Clin. Chem.14. 253-259 (1985)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi, M.: "Determination of tryptophan with N-bromosuccinimide using the stopped-flow method." Anal. Sci.1. 89-90 (1985)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Igushi, T.: "Study of polysaccharides by the fluorescence method, 6. Kinetics of the salt-induced conformation of xanthan polysaccharide." Makromol. Chem., Rapid. Commun.7. 497-503 (1986)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kakitani, M.: "Valyl-tRNA synthetase from Bacillus stearothermophilus. Purification and binding with the substrates L-valine and ATP." Agric. Biol. Chem.50. 2437-2444 (1986)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kitagishi, K.: "Binding between thermolysin and its specific inhibitor, N-phosphoryl-L-leucyl-L-tryptophan (PLT)" J. Biochem.99. 191-197 (1986)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanaka, A.: "Equilibrium and kinetic studies on the binding of gluconolactone to almond beta-glucosidase in the absence and presence of glucose." J. Biochem.100. 1379-1385 (1986)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kakitani, M.: "Fluorometric study on the interaction of amino acids and ATP with valyl-tRNA synthetase from Bacillus stearothermophilus." J. Biochem.101. 477-484 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kakitani, M.: "Order of binding of substrate to valyl-tRNA synthetase from Bacillus stearothermophilus in amino acid activation reaction." Biochem. Internl.14. 597-603 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kanaya, K.: "Determination of low concentration of protein by the Biuret method using the "stopped-flow time difference analysis" technique." Agric. Biol. Chem.51. 1885-1892 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kanaya, K.: "Spectrophotometric determination of protein by the stopped-flow time difference analysis technique to enhance the sensitivity of the Coomassie Brilliant Blue-binding method." Agric. Biol. Chem.52. 2615-2616 (1988)

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  • [文献書誌] Kanaya, K.: "Application of the "micro-stopped-flow time difference analysis" technique to a dehydrogenase catalyzed reaction for rapid and sensitive determination of pyruvate." Agric. Biol. Chem.52. 2563-2568 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kitagishi, K.: "Kinteic studies on the binding of gostatin, a suicide substrate for aspartate aminotransferase, with the isoenzymes from porcine heart mitochondria and cytosol." J. Biochem.103. 585-588 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakatani, H.: "Kinetic study on the interaction of Rhizopus chinensis aspartic protease with Streptomyces pepsin inhibitor (acetylpepstatin)." Arch. Biochem. Biophys.263. 311-314 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Akasaka, K.: "Internal motion of a tryptophan residue in Streptomyces subtilisin inhibitor: Deuterium nuclear magnetic resonance in solution." Protein: structure, function and genetics. 4. 131-136 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hiromi, K.: "Principles and Developments of the Subsite Theory with Special Reference to Amylase-Catalyzed Reaction." Denpun Kagaku (J. Jpn. Soc. Starch Sci.). 32. 84-93 (1985)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hiromi, K.: "Time Ranges of Enzyme-Catalyzed Reactions." Tampakushitsu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic Acid, and Enzyme ). 28. 32-36 (1985)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakatani, H.: "Temperature-Jump Method." Tampakushitsu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme). 28. 200-203 (1985)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakatani, H.: "Location of the enzyme functions on the time scale." Tampakushitsu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme). 28. 321-323 (1985)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi, M.: "Active-Site Structure of Rhizopus niveus Glucoamylase." Denpun Kagaku (J. Jpn. Soc. Starch Sci.). 34. 58-65 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hiromi, K.: "Interaction between Proteases and Proteinaceous Inhibitors; With Special Reference to Streptomyces Subtilisin Inhibitor (SSI)." Nippon Nogeikagaku Kaishi. 62. 1805-1827 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tonomura, B.: "Equilibrium and Kinetic Studies on the Interaciton of Proteases and Protein Protease Inhibitors." Nippon Nogeikagaku Kaishi. 62. 1814-1917 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Akasaka, K.: "Rigidity and Flexibility are Both Important in the Molecular Design of Protease Inhibitor, SST." Nippon Nogeikagaku Kaishi. 62. 1818-1822 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hiromi, K.: Protein protease inhibitor--- The case of Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI).Elsevier, 481 (1985)

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  • [文献書誌] Hiromi, K.: Koso II (Enzymes II). Asakura Shoten, 187 (1985)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi, M. (Nakamura, M. ed.): Amylases -- Approaches to Bio-Engineering. Gakkai Shuppan Center, 374 (1986)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ohnishi, M.: Introduction to the Expriments of Enzyme Reaction Kinetics. (in Japanese). Gakkai Shuppan Center, 218 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hiromi, K. and Ohnishi, M.: Handbook of Amylases and Related Enzymes.Pergamon Press, 274 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 廣海啓太郎: 日本農芸化学会誌. 62. 1805-1810 (1988)

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      1988 実績報告書
  • [文献書誌] 外村辨一郎: 日本農芸化学会誌. 62. 1814-1817 (1988)

    • 関連する報告書
      1988 実績報告書
  • [文献書誌] 赤坂一之: 日本農芸化学会誌. 62. 1818-1822 (1988)

    • 関連する報告書
      1988 実績報告書
  • [文献書誌] Kitagishi,K.: J.Biochem.103. 585-588 (1988)

    • 関連する報告書
      1988 実績報告書
  • [文献書誌] Nakatani,K.: Arch.Biochem.Biophys.263. 311-314 (1988)

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公開日: 1987-03-31   更新日: 2016-04-21  

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