| 研究課題/領域番号 |
60440007
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| 研究種目 |
一般研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
発酵工学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岡田 弘輔 大阪大学, 工学部, 教授 (20028947)
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| 研究分担者 |
根来 誠司 大阪大学, 工学部, 助手 (90156159)
卜部 格 大阪大学, 工学部, 助教授 (60029246)
新名 惇彦 大阪大学, 工学部, 助教授 (30029235)
山田 靖宙 大阪大学, 工学部, 教授 (00011891)
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| 研究期間 (年度) |
1985 – 1988
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| 研究課題ステータス |
完了 (1988年度)
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| 配分額 *注記 |
17,400千円 (直接経費: 17,400千円)
1988年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
1987年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1986年度: 6,100千円 (直接経費: 6,100千円)
1985年度: 9,100千円 (直接経費: 9,100千円)
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| キーワード | ナイロンオリゴマー分解酵素 / ハイブリド酵素 / プラスミド / アミノ酸置換 / 酵素進化 / ナイロンオルゴマー分解酵素 / ナイロンオリゴマー / ハイブリド分解酵素 / 蛋白質工学 |
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| 研究概要 |
酵素蛋白質のアミノ酸配列と機能との関係を理解するために、Flavobacterium sp.KI72株のナイロンオリゴマー分解酵素をモデルとして、微生物の人工化合物への適応のプロセスを研究してきた。親株の有するプラスミドpOAD2上には、6ーアミノカプロン酸鎖状2量体加水分解酵素(EII)および、その進化起源と考えられる類似蛋白質(EII′)もコードされており、酵素進化を実験室レベルで解明する上で良いシステムになっている。EIIおよびEII′は共に免疫学的に交叉反応を示し、いずれも392アミノ酸残基から成るが、このうち47残基が相違している。EII′はEIIの1/100の酵素活性しかないが、47残基のうち少数のアミノ酸がEIIの対応するアミノ酸に置換されるとEIIレベルの高活性を示す。両遺伝子間で共通に保存されている制限酵素サイトを用いて2種の酵素間で対応するペプチド領域を交換し、種々のハイブリド酵素を作成し、その性質変化を調べた。その結果EII′からEIIへの酵素活性上昇には、BglII〜SalI領域(N末端から162〜257番目のアミノ酸残基、4アミノ酸残基が相違している)およびSalI〜BamHI領域(N末端から258〜380番目のアミノ酸残基、15アミノ酸残基が相違している)の両者が必須であることがわかった。さらに、BglII〜SalI領域で1アミノ酸にのみミスマッチをもつハイブリド酵素を作成して解析したところ、181番目のGly(EII′)からAsp(EII)への置換が必須であることがわかった。この181番目のAspを他のアミノ酸に変化させるとVmでは顕著な差が見られないがKmは増大することから、活性の上昇には181番目のアミノ酸がAspであることが必須であると結論した。一方、SalI〜BamHI領域では、266番目のHis(EII′)からAsn(EII)への置換が必須であることが明らかになった。
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