細胞工学的手法を用いた活性高分子物質の細胞内導入による疾病細胞の治療の基礎的研究

• 研究課題/領域番号: 60440096
• 研究種目: 一般研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 医学一般
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 内田 驍 大阪大学, 細胞工学センター, 教授 (40029781)
• 研究分担者: 石浦 正寛 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助手 (20132730) ; 米田 悦啓 大阪大学, 細胞工学センター, 助手 (80191667) ; 目加田 英輔 大阪大学, 細胞工学センター, 助手 (20135742) ; 金田 安史 大阪大学, 細胞工学センター, 助手 (10177537) ; 山泉 克 大阪大学, 細胞工学センター, 助教授 (70107093) ; 河野 憲二 大阪大学細胞工学センター (50142005)
• 研究期間 (年度): 1985 – 1987
• 研究課題ステータス: 完了 (1987年度)
• 配分額: 27,600千円 (直接経費: 27,600千円); 1987年度: 6,500千円 (直接経費: 6,500千円); 1986年度: 8,600千円 (直接経費: 8,600千円); 1985年度: 12,500千円 (直接経費: 12,500千円)
• キーワード: DNAと蛋白質の細胞への注入 / ガングリオシドも持ったリポソーム / 赤血球膜 / EF2の構造と機能 / 高分子物質 / 細胞内導入 / 活性ペプチド / 巨大高分子 / 細胞内注入 / 疾病細胞

研究概要

DNA等の巨大高分子物質の細胞への効率良い注入法の開発を行った. 裸のリポソームに10kb以上のDNAを包む事は容易であるが, 細胞と融合せず細胞内へ注入する事が出来ない. そこでこのリポソームとHVTを保温して細胞に加えると約10%の細胞にDNAの一時的発現がみられた. さらにリポソームの構成分の1つとしてガングリオシドを用い, これにHVJを加えて細胞に添加すると, 全細胞にDNAの一時的発現がみられた. 赤血球膜とDNAを混合し非イオン性界面活性剤を添加後希釈すると, 赤血球膜にDNAやIgMを包む事ができる. しかしこの赤血球膜は受容細胞との融合率が低くわずか約10%の細胞にDNAの一時的発現がみられるだけである. そこでガングリオシドを持ったリポソームをこの赤血球膜に加えHVJと共に細胞に添加すると, 全ての細胞にDNAの一時的発現がみられた. 以上の事から, 赤血球膜に蛋白質を, リポソームにDNAを包みHVJで融合させ細胞に加えて, 同じ細胞にDNAと蛋白質を同時に注入する事も可能になった. これ等の方法はDNAを細胞質に送り込む方法であり, DNA発現の場は核であることから, DNAの核への運搬を考えねばならない. HMG1のモノクローナル抗体はHMG1によって核へ運搬される事を明らかにした. この事から, 核蛋白質は核への運搬ドメインとDNAとの結合ドメインの2つを持っている事が明らかになった. ここでDNAを核へ効率良く運搬させる可能性が生まれた. ジフテリア毒素フラグメントAを裸のリポソームに入れておくと, このリポソームはSSPEやHIVウイルスの感染した融合細胞に選択的に融合して, これ等疾病細胞のみを選択的に殺す事ができた. フラグメントAの基質であるペプチド伸長因子2(EF2)やその毒素耐性変異EF2のCDNAをクローニングした. この事からEF2の構造と機能が明らかになり細胞生物学研究への応用への道も拓く事が出来た.

研究成果

• [文献書誌] Tsuneoka,M.,Imamoto,N. and Uchida,T.: J. Biol. Chem.261. 1829-1834 (1986)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yamaizumi,M.,Sugano,T.,Asahina,H.,Okada,Y. and Uchida,T.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83. 1476-1479 (1986)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kohno,K.,Uchida,T.,Ohkubo,H.,Nakanishi,S.,Nakanishi,T.,Fukui,T.,Ohtsuka,E.,Ikehara,M., & Okada,Y.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83. 4978-4982 (1986)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Wataya-Kaneda,M.,Kaneda,Y.,Sakurai,T.,Sugawa,H. and Uchida,T.: J. Cell Biology.104. 1-7 (1987)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kaneda,Y.,Uchida,T.,Kim,J.,Ishiura,M. and Okada,Y.: Exp. Cell. Res.173. 56-69 (1987)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Imamoto-S,N., Yoneda,Y.,Iwamoto,R., Sugawa.H. and Uchida,T.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.IN PRESS.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yoshimori,T. and Uchida,T.: "Monoclonal antibodies against bacteria: volume III. Monoclonal antibody against diphtheria toxin″. ed. by A.J.Macario and E. Conway de Macario" Academic Press Inc. New York., 19 (1986)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Mekada,E.,Moynihan,M.R. and Uchida,T.: "in ″Handbook of natural toxin: volume 3, Bacterial Toxins″ ed. by Hardegree, Habig and Tu, A.T." Marcel Dekker Inc. New York.,
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Tsuneoka,M., Imamoto,N. and Uchida,T.: "Monoclonal antibody against non-histone chromosomal protein HMG-1 co-migrates with HMG-1 into the nucleus." Journal of Biological chemistry. 261. 1829-1834 (1986)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yamaizumi,M., Sugano,T., Asahina,H., Okada,Y. and Uchida,T.: "Microinjection of partially purified protein factor restores DNA damage specifically in group A of xeroderma pigmentosum cells." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83. 1476-1479 (1986)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kohno,K., Uchida,T., Ohkubo,H., Nakanishi,S., Nakanishi,T., Fukui,T., Ohtsuka,E., Ikehara,M., and Okada,Y.: "Amino acid sequence of mammalian elongation factor 2 predicted from the cDNA sequence: Homology with GTP-binding proteins." Prc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83. 4978-4982 (1986)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Wataya-Kaneda,M., Kaneda,Y., Sakurai,T., Sugawa,H. and Uchida,T.: "A monoclonal antibody against the nucleus reveals the presence of a common protein in the nuclear envelope, the perichromosomal region and cytoplasmic vesicles." J. Cell biology.104. 1-7 (1987)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kaneda,Y., Uchida,T., Kim,J., Ishiura,M. and Okada,Y.: "The improved efficient method for introducting macromolecules into cells using HVJ(Sendai Virus) liposomes with gangliosides." Exp. Cell Res.173. 56-69 (1987)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Mekada,E., Moynihan,M.R. and Uchida,T.: in "Handbook of natural toxin: volume 3, Bacterial Toxins" ed. by Hardegree, Habig and Tu, A.T.Marcel Dekker Inc. New York.,
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tsuntoka,M.;Imamoto,N.;Uchida,T.: J.Biol.Chem.261. 1829-1834 (1986)
• [文献書誌] Yamaizumi,M.;Sugano,T.;Asahina,H.;Okada,Y.;Uchida,T.: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83. 1476-1479 (1986)
• [文献書誌] Takamatsu,K.;Uchida,T.;Okada,Y.: Biochem.Biophys.Res.Commun.134. 1015-1021 (1986)
• [文献書誌] Kohno,K.;Uchida,T.;Ohkubo,H.;Nakanishi,S.;Nakanishi,T.;Fukui,T.;Ohtsuka,E.;Ikehara,M.;Okada,Y.: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83. 4978-4982 (1986)
• [文献書誌] Wataya-Kaneda,M.;Kaneda,Y.;Sakurai,T.;Sugawa,H.;and Uchida,T.: J.Cell Biology. 104. 1-7 (1987)
• [文献書誌] Yoneda,Y.;Arioka,T.;Imamoto-Sonobe,N.;Shimonishi,Y.;Uchida,T.: Exp.Cell Res.(1987)
• [文献書誌] Yoshimori,T.;Uchida,T. ed.by A.J.L.Macario;E.C.de Macario: "Monoclonal antibodies against bacteria,vol.III" Academic Press, 346 (1986)
• [文献書誌] Uchida,T.ed.by F.Dorner;J.Drews: "Pharmacology of Bacterial Toxins" Pergamon Press, 748 (1986)
• [文献書誌] Exp.Cell Res.159. (1985)
• [文献書誌] Exp.Cell Res.159. (1985)
• [文献書誌] Exp.Cell Res.159. (1985)
• [文献書誌] J.Biol.Chem.260-22. (1985)
• [文献書誌] J.Biol.Chem.260-22. (1985)Pro.Natl.Acad.Sci.USA.