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光エネルギー共役再構成膜を用いたテトラサイクリン能動輸送担体の研究

研究課題

研究課題/領域番号 60571032
研究種目

一般研究(C)

配分区分補助金
研究分野 生物系薬学
研究機関千葉大学

研究代表者

山口 明人  千葉大, 薬学部, 講師 (60114336)

研究期間 (年度) 1985 – 1986
研究課題ステータス 完了 (1986年度)
配分額 *注記
1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
1986年度: 300千円 (直接経費: 300千円)
1985年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
キーワードテトラサイクリン / 逆輸送 / 反転膜小胞 / 再構成膜 / バクテリオロドプシン / 排出系 / 耐性菌 / 能動輸送
研究概要

耐性菌によるテトラサイクリン排出機構の性質を解明するため、まず、耐性菌より調製した反転膜小胞を用いて、テトラサイクリン輸送のエネルギー共役機序を検討した。この研究の途中経過において、TC排出系が主としてΔPHによって駆動される【H^+】との逆輸送系であることを見出し報告した(論文リスト1)。ΔPHとTC蓄積量の関係は傾き1の直線的比例関係であり、これは、TCの輸送が【H^+】との1=1の交換によることを示している。一方、ΔΨに関ては、当初、人工的ΔΨ7=よりTC輸送が駆動されないことから電気的に中性な輸送と考えていた。しかし、その後の詳しい解析から 17mV以上のΔΨが与えられた場合にはΔPHがなくともTC輸送が駆動されることが見出された。ΔPHに関してはこのような閾値は存在せず、OmVから直線的に比例するが、Rineticsの解析からは、50mV以下のΔPHでは輸送担体のTCに対する親和性が低く、輸送系の効率が悪くなることが示された。
次に、輸送担体である膜蛋白質tetAを固定するため、TC耐性遺伝子をマルチコピープラスミドにクローニングし、マキシセルを調製してプラスミド性蛋白を35S-メチオニン標識した。これにより、35KDaの分子量を持つtetAが同定され、オクチルグルコシドにより可溶化された。しかし、放射性標識は大量精製に適さず、減衰の問題もあるため、次に抗体による同定法を確立した。tetA遺伝子の塩基配列により決定されたC末の14アミノ酸相当のペプチドを合成し、このペプチドに対する抗体を調製した。この抗体はtetA蛋白を抗原として認識することが確認された。この抗体をCNBrセファロースに結合したアフィニティーカラムを用いてtetA蛋白の精製を行った。
次に、再構成膜でのエネルギー供与系としてバクテリオロドプシンを組み込み、光共役にプロトン駆動力を生じるリポソームを調製した。この膜へのtetA組み込みは新年度の課題である。

報告書

(1件)
  • 1986 研究成果報告書概要
  • 研究成果

    (8件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (8件)

  • [文献書誌] M.Kaneko;A.Yamaguchi;T.Sawai: FEBS Letters. 193. 194-198 (1985)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1986 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Kaneko;A.Yamaguchi;T.Sawai: J.Pharmacobio-Dyn.10. -30 (1987)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1986 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Kaneko-Ohdera;Y.Iwasaki;A.Yamaguchi;T.Sawai: Eur.J.Biochem.

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1986 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Kaneko-Ohdera;A.Yamaguchi;T.Sawai: FEMS Microb.Letters.

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1986 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M. Kaneko, A. Yamaguchi and T. Sawai: "Energetics of tetracycline efflux system encoded by Tn 10 in Escherichia coli." FEBS Letters. 193. 194-198 (1985)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1986 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M. Kaneko, A. Yamaguchi and T. Sawai: "Studies on the tetracycline efflux system in tetracycline resistant strains of Escherichia coli." J. Pharmacobio-Dyn.10. s-30 (1987)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1986 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M. Kaneko-Ohdera, Y. Iwasaki, A. Yamaguchi and T. Sawai: "Relationship between the tetracycline transport and the components of the electrochemical proton gradient in inverted membrane vesicles prepared from tetracycline resistant Escherichia coli." Eur. J. Biochem.

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1986 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M. Kaneko-Ohdera, A. Yamaguchi and T. Sawai: "The dependence of tetracycline resistance on proton motive force in Escherichia coli." FEMS Microb. Letters.

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1986 研究成果報告書概要

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公開日: 1987-03-31   更新日: 2016-04-21  

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