| 研究概要 |
海洋細菌Vibrio alginolyticusの呼吸鎖には【Na^+】排出活性と直接共役するユニークな【Na^+】依存のNADH-Quinone reductase複合体が存在し、これによってユビキノンの還元はセミキノンを経てキノールを生成する2段階の反応で進むことを見いだした。このとき後半の反応のみが【Na^+】依存でありHQNDで阻害されることからキノール生成が【Na^+】排出活性と共役すると考えられた。そこで本研究ではこのreductase複合体の精製を行い各構成蛋白の分子的特徴及びその機能を解析した。
まず膜分画より界面活性剤を用いて可溶化後、高速液体クロマトを用いて精製した結果、本酸素複合体は分子量が各5.2万,4.6万,3.2万の3種のサブユニットα,β,γからなり、FADとFMNを含むことがわかった。そこで各サブユニットの単離方法を検討し、αβγ複合体以外にα,β,およびβγ分画を分離することが出来た。βは、I分子のFADを含みキノンをセミキノンに還元するNADH dehydrogenaseであった。αはI分子のFMNを含むフラビン蛋白であるが、単独では活性を示さなかった。γは、まだ単離に成功していないが、βγもNADH dehydrogenase活性のみを示し、βとの比較からγはβに対するキノンの親和性を高めるように作用した。キノールを生成するreductase活性は、αとβγからのみ再構成出来、FADとFMNが等量存在する時最高の活性が回複された。従ってキノール精製にはα,β,γの3種のサブユニットを必須とし、NADHからの電子はβ(FAD)→γ→α(FMN)の順で伝達される。またαβγ複合体の活性型構造は分子量25,4万であることから(αβγ)の2量体または【α_2】【β_2】【γ_2】と考えられる。一方精製したαβγ複合体をリポソームに再構成し膜電位形成を測定した結果、キノール生成と平行して【Na^+】依存性,HQNO感受性の膜電位が形成された。従ってαがγ共存下にセミキノンをキノールに還元する際に、【Na^+】排出と共役すると考えられた。
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