| 研究概要 |
先づ正常雄ラット下垂体の凍結切片上で、ACTH,プロラクチンのmRNAを検出するための新しいin situ hybridization法を確立した。ラット下垂体の凍結切片を0.5%グルタールアルデヒドで30分間固定、洗浄後1μg/mlのプロティナーゼKで37℃30分間消化する。ニックトランスレーションでラベルした【^3H】-cDNAを30℃48時間作用させ高塩濃度の緩衝液で洗浄、乳剤でコートし露光する。この方法で標本を処理すると約3週間露光するだけで、プロラクチン,ACTHのmRNA検出が可能である。本法を基本としてさらにmRNA検出感度を上げるため以下の改良を試みた。
(1) 下垂体を摘出後常法によりパラフィンに包埋し、その切片についてhybridizationを行なった所、感度はむしろ低下した。これは包埋過程での熱処理がmRNAを破壊するためと考えられる。そこで37℃で包埋できる特殊なパラフィンを用いることにより感度の低下を防ぐことに成功した。
(2) hybridizationを行なう際の緩衝液の組成のうち、ホルムアミドとデキストラン硫酸の割合を増加させた。これにより一本鎖DNAが安定となり検出感度即ち、細胞当りの銀粒子数が増加した。
(3) より高比活性の【^3H】-cDNAを作成するため、【^3H】一核酸を種々の濃度のDNAと反応させて、DNAの至適濃度を明らかにした。cDNAの比活性は従来の約1.5倍(1×【10^7】cpm/μgDNA)に増加した。
(4) 反応系全体について、溶液中のRNase活性を低下させる自的で実験に用いるすべての試薬作成には、ジェチルピロカーボネートで処理した水を使用した。これにより検出される銀粒子数は明らかに増加した。 これらの改良により、胎生後期の下垂体にACTH,とGHのmRNAを証明,プロラクチン遺伝子発現はその後起る事が推定された。
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