| 研究課題/領域番号 |
61480492
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
人類遺伝学
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
安河内 幸雄 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (60037398)
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| 研究期間 (年度) |
1986 – 1988
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| 研究課題ステータス |
完了 (1988年度)
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| 配分額 *注記 |
4,500千円 (直接経費: 4,500千円)
1988年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1987年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1986年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
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| キーワード | ヒトβグロビン / in vitro転写 / HeLa細胞 / ヒトβーグロビン / 転写 / ヒトβ-グロビン |
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| 研究概要 |
真核生物において最小のプロモーターをもつ遺伝子の正確な転写開始には、RNA polymeraseIIに加えていくつかの蛋白因子が必須である。我々はカラムクロマトグラフィーによりこれら蛋白因子をHeLa細胞核抽出液から精製することを試みた。6つの蛋白因子(FA、FB、FC、FD、FEおよびFF)がヒトβグロビンプロモーターによる正確な転写開始に必要であった。つまりFA、FB、FC、FD、FE及びFFはゲル濾過において52K、540K、285K、700K、185K及び130Kの分子量領域にそれぞれ活性をもち、お互いに特異的な蛋白であることを示唆した。またSarkosyl Block実験において6つの蛋白因子は0.2%Sarkosylを加える前に反応液中に存在しないと転写活性を示さなかった。従ってInitiation complex形成に関与していることが明らかとなった。我々はこれら蛋白因子のうちFA、FC及びFEを高度に精製することに成功した。FAはDIP^2よりSpTOYO、ゲル濾過及びCM-HPLCにより精製された。最終標品はSDS-PAGE後の銀染色により分子量27Kと推定され、80%以上の精製度であった。精製トリプチックペプタイドのアミノ酸配列はAIKVEQATKであった。これより演繹されるオリゴDNAでつり上げられたクローンの1つについてコーディング部分のDNA配列を解析した結果、チロシン及びプロリンの含有量が高く塩基性の強い蛋白が推定された。FCはD2P2よりDEAE-TOYO、ゲル濾過、DEAE-HPLC、及びTATAカラムクロマトグラフィーにより精製された。最終標品では転写活性はDNA結合活性とは分離し、SDS-PAGE上80Kと55Kのバンドが転写活性と、また120KのバンドがDNA結合活性と関連していた。FEはD2P2よりDEAE-TOYO、ゲル濾過、DEAE-HPLC、さらにグアニジン塩酸を含むバッファー中でのゲル濾過により精製された。Renaturation後、転写活性を測定すると、SDS-PAGE上33Kのバンドに活性が認められた。FEの最終標品は銀染色において80%以上の精製度を示した。
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