In situハイブリダイゼーション法による植物ウイルス核酸合成の細胞学的研究

• 研究課題/領域番号: 61560049
• 研究種目: 一般研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 植物保護
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 細川 大二郎 東京農工大学, 農学部, 助教授 (50014957)
• 研究期間 (年度): 1986 – 1987
• 研究課題ステータス: 完了 (1987年度)
• 配分額: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円); 1987年度: 500千円 (直接経費: 500千円); 1986年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
• キーワード: In situ ハイブリダイゼーション / タバコモザイクウイルス / ビオチン標識核酸プローブ / In situハイブリダイゼーション / TMV

研究概要

ビオチン標識核酸プローブは放射性同位元素標識核酸プローブより取り扱いが容易であり, in situハイブリダイゼーション法に用いる場合にも, 蛍光色素, 酵素, 金コロイドなど種々のマーカーが利用できるなど有用な点が多い. そこで, in situハイブリダイゼーション法によりタバコモザイクウイルス(TMV)-RNAのプラス鎖及びマイナス鎖を検出するために, ビオチン標識RNAプローブを作製した. TMVの外殻たんぱく質遺伝子のcDNAをSP6プロモーターを持つプラスミドに逆方向に挿入し, ビオチンー11-UTPを加えた反応液でSP6ポリメラーゼを用いてRNAを合成することにより作製した. 一方TMV-RNAのマイナス鎖検出用プローブは, TMV-RNAをアルカリ処理により断片化(200〜600塩基)し, これにフォトビオチンを用いてビオチンを標識する方法で作製した. これらのプローブは, ナイロン膜上に固定したTMV-RNAあるいはTMV感染タバコから抽出した二本鎖TMV-RNAとドット. ブロットハイブリダイゼーションを行い, アルカリホスファターゼ標識アビジンと反応させ, ニトロブリュー・テトラゾリウムで発色させる方法により, 標的RNAと反応することが認められた. またこれらのプローブを用いてスライドグラス上に塗未したTMV感染タバコプロトプラストでin situハイブリダイガーションを行うと, 細胞内にTMV-RNAを検出できた.
これらのプローブを用いた電顕レベルにおけるin situハイブリダイゼーションは現在検討中である.