| 研究概要 |
補酵素NADと脱水素酵素を不溶性担体であるSepharoseに固定化した補酵素再生系を確立し, フローインジェクション分析(FIA)法への適用を行った.
1.グルタルアルデヒド(GA)を用いたNADの直接固定化法を開発した. NADの固定化様式はGA活性化Sepharoseとの反応pHに依存した. 酸性領域(pH3)ではGA活性化Sepharose上のαβ不飽和アルデヒドとNADのアデニン環環外アミノ基がメチロール型構造を形成して結合することが示唆された. 中性領域(pH8)ではNADのリン酸部分が担体の正電荷との間でイオン的な相互作用により結合することが示唆された. pH8で固定化されたNADは高い補酵素活性を有していることが認められ, アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)との同時固定化に適用された.
2.ADH, NADの同時固定化には, 臭化シアン活性化SepharoseにヘキサメチレンジアミンとGAを各々3回反応させてスペーサーを導入した修飾ゲル(R_3-Seph)を用いた. 同時固定化ゲルの再利用性はGAの反応時間に大きく依存していた. これはGAのアルドール縮合により形成される担体上の立体的な構造に起因すると考えられた. 最適条件(各段階でのGA反応を5%濃度, 2時間)で調製したADH, NAD同時固定化ゲルは0〜0.8mMエタノールに対しバッチ法での定量性が認められた.
3.ADH, NAD, ジアフォラーゼ三者同時固定化ゲルを調製した. この場合にもGAの反応条件は再利用性及び活性に大きな影響を与えた. R_3-Seph調製の際の最適条件は, GA濃度20%, 反応時間1時間であった. 最適条件で調製した三者同時固定化ゲルを用いてFIA法によるエタノールの定量を行った. 0.1〜0.5Mの範囲で濃度依存性が認められ, エタノール定量に十分な適用性を有することを確認した.
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