| 研究概要 |
cholineacetyl transferase(ChAT)はアセチルコリンの合成酵素であるので, コリン作動性神経の得意マーカーとなり得る. 魚類のChATに対する抗体が得られれば, これを用いて魚類のコリン性神経を免疫組織化学的に染めることができる. 本研究では豊富にChATを含有するシビレエイ電気器官からのChATの精製と, これに対する抗体の作製を行なった.
ChATの活性測定法を種々検討した結果, Fonnum(1969)の原法に基づいたRyanとMcclure(1979)の方法を採用することにした. シビレイエイNarke japonica2尾を入手し, その電気器官約200gを材料として精製を試みた. RyanとMcclure(1979)の方法に従って精製を行なったが, 抽出に続く酸沈澱では酵素活性のほとんどが失われたため, この過程を除くこととした. 続く硫安沈澱過程では40〜80%フラクションを取った. イオン交換クロマトでは原法の緩衝液pHではシビレイエイのChATはゲルに吸着しなかった. そこで緩衝液のpHを6.8に下げたところ吸着率が大幅に改善された. 塩化ナトリウム濃度0.2M付近の活性ピークを集めた. アセチルCoA-セファロース・クロマトでは塩化ナトリウム濃度0.6-0.8Mの酵素活性ピークを集めた. 続くハイドロキシルアパタイト・クロマトでは塩化ナトリウムで溶出するピークと硫安で溶出するピークが得られた. この酵素標品を用いてウサギを免疫し抗血清を得た. 本抗血清を使いニジマス脊髄の凍結切片を蛍光抗体法により染色したところ, 本抗血清は極めて特異性に乏しく実用に耐えないことが分かった.
本研究の結果, シビレイエイChATの精製は哺乳類の場合と同様極めて困難であることが明らかとなった. 今後はコリン性神経に対する特異抗体を得るためにはChATのモノクローナル抗体を取るかあるいはアセチルコリンそのものに対する抗体を作製するのが早道と考えられる.
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