| 研究概要 |
マメ類の種子中には, 塩可溶性貯蔵タンパク質および種々のプロテアーゼインヒビターなどが含まれている. これらのタンパク質は, 種子の分化成熟に伴い合成貯蔵される. この遺伝的な制御機構を解析するために, 本当はプロテアーゼインヒビターcDNAをクローニングし, その塩基配列を決定するとともに, このcDNAをプローブとしてマメの登熟過程におけるインヒビターmRNAの貯積を解析した.
シカクマメの開花後35日目の未熟種子より全ポリ(A)^+RNAを調製し, Gubler&Hoftmanの方法を基に2本鎖cDNAを合成した. EcoRI部位をメチル化し, EcoRIリンカー付加に続いてEcoRI消化し, λgt11ベクターのEcoRI部位に挿入し, cDNAライブラリーを作製した. キモトリブシンインヒビターWCI-3に対する抗血清を用いてスクリーニングし, 候補cDNAクローンを得た. このcDNAをプラスミドにサブクローニングし, サンガー法により全塩基配列を決定した. cDNAは762塩基からなり, 207アミノ酸からなるペプチドをコードしていた. 25番よりC末端までの183残基からなる推定アミノ酸配列は, WCI-3の一次構造と完全に一致し, WCI-3cDNAであることが確認された. N末端に存在する24アミノ酸からなる領域は, 疏水性アミノ酸に富み, シグナルペプチドと推定された.
このcDNAをプローブとして, 開花後30, 35, 40日目のシカクマメ種子より調製した全ポリ(A)^+RNAをノザン分析した結果, 35および40日目の種子中にはWCI-3mRNAが存在するが, 30日種子中には存在しないことが確認された. mRNAの検出とインヒビタータンパク質の出現が一致することから, WCI-3の合成制御はmRNAの蓄積によることが明らかになった.
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