| 研究概要 |
真核細胞mRNAの5′末端に存在するキャップ構造(m7GpppNm-)の形成には少くとも4種類の一連の酵素活性が関与する. 我々は, このうち, キャップ構造の基本骨格(G(5′)pppN-)の形成を触媒するキャッピング酵素を種々の真核生物から精製し, それがmRNAグラニル酸転移酵素(GTase)とRNA5′-トリ木スファターゼ(TPase)の両活性から構成されていることを明らかにしてきた. 本年度は, キャッピング酵素の構造と機能をさらに解明するために酵母(Saccharomyces cerevisiae)のキャッピング酵素遺伝子について研究を行い以下の成果を得た.
(1)酵母キャッピング酵素はα(52KDa)β(80KDa)2種類のサブユニットから成り, αがGTaseを, βがTRase活性を担う. λgtllを発現ベクターとする酵母染色体遺伝子ライブラリーを酵母キャッピング酵素に対する抗体をプローブにスクリーニングし, ポジティブクローンを得た. epitape selectionを用いて, これがGTase遺伝子を含むことを示した.
(2)このクローンは約3.5Kbの酵母DNAが押入されてあり, 塩基配列の分析からその中に約52.8kDaと50.9kDaのタンパク質をそれぞれコードしうる2つのopen reading frame(ORF)が存在することを明らかにした. (3)大腸菌内における遺伝子発現の実験から52.8KDaのタンパク質をコードするORFがGTase 遺伝子であると同定した.
(4)遺伝子の一次構造の解析ならびに酵母GTase mRNAのノザンプロット分析の結果から, 酵母キャッピング酵素のα, βサブユニットはそれぞれ独立した遺伝子によってコードされていることが明らかとなった. この事実は, GTaseとTPaseが一本のポリペプチド鎖上にドメインとして存在する動物細胞のキャッピング酵素と比較して興味深い.
(5)酵母における遺伝子破壊の実験から, GTase遺伝子は酵母の生育にとって必須であることを明らかとした.
|
