| 研究概要 |
1.(1)菌体外中性(npr), アルカリ(apr)両プロテアーゼ欠損と胞子形成初期遺伝子の高温感受性変異spoOAts-7をもつ変異株と菌体外アルカリプロテアーゼのプロモーターを欠いたプロモーター検索ベクター, PSBを用いたショットガン法により37°Cでスキムミルクを含む胞子形成培地上でハローを形成するが, 43°では形成しない. spoOA依存プロモーターと思われるDNA断片を三種(E2, S2, S3)クローン化することができた. (2)3種のプロモーターはいずれも胞子形成期の初期にのみ発現が開始されることが, 培養液中に分泌されるセリンプロテアーゼの活性を測定することにより判明した. 3.これらのプロモーターを含むDNA断片を大腸菌でのみ増殖可能なマッピングプラスミドpCP112に導入し, 次に枯草菌の染色体に組込みCmrをマーカーとしてPBS1によるマッピングを行なった. その結果E2はaroD-leuA, S2はpurB-tre, S3はrif-strA近傍にマップされた. 中でもS3は枯草菌の近縁種のみならずグラム陰性奇菌の大腸菌などでも保存度の高い転写・ほん訳に関与する遺伝子群の中にマップされ, その順序はcySA14-spoOH-rif-StrA-(S3)Cmであった. 3.次に上記のS3断片の塩基配列を決定したが, ORFの一部しか含まれていなかったので, Walking法によりさらに大きなDNA断片をクローン化し, その塩基配列の決定を行なっている. 現在まで, S3遺伝子-rpsJ(S10)〜rplC(L3)の順であることがわかった. しかしS3遺伝子についてはアミノ酸配列に相同性がみられるタンパクは見い出せなかった. 今後は, S3遺伝子を不治化した場合どのような表現型を示すかを検討していきたい.
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