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蛋白質工学によるリボ核酸分解酵素の基質認識機構の研究

研究課題

研究課題/領域番号 62570939
研究種目

一般研究(C)

配分区分補助金
研究分野 化学系薬学
研究機関大阪大学

研究代表者

西川 諭  大阪大学, 薬学部, 助手 (70150307)

研究分担者 田中 俊樹  大阪大学, 薬学部, 助手 (70171775)
研究期間 (年度) 1987 – 1988
研究課題ステータス 完了 (1988年度)
配分額 *注記
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
1988年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1987年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
キーワード蛋白質工学 / 構造活性相関 / RNase T_1 / RNA鎖切断反応機構 / 基質特異性変換 / RNaseT_1
研究概要

1.特定の塩基を認識する機構の研究:RNase T_1と阻害剤2′GMPの複合体のX線結晶解析をもとに、グアニン塩基認識部位のアミノ酸残基を人工的に置換し、アデニン塩基特異性に変えることを試みた。そのために、RNase T_1に比べ、アデニン塩基にも親和性のあるRNase Msとのハイブリッドプロテインを2種類と塩基結合部位のふたの役目をしているTyr45をTrpに変えた変換体と、グアニン塩基のN1位を認識しているGlu46をAlaに変えた変換体を作製した。pApCに対する切断活性/pGpCに対する切断活性の相対活性で比較すると、いずれもRNase T_1に比べ数10から数1000倍、特異性が変化していた。しかし活性の絶対値はRNase T_1に比べ著しく低下していた。活性の低下をできるだけ抑えたまま特異性を変化させる為に、今後、RNase T_1と基質類似体の複合体のより精密な構造の情報を得ることを計画している。
2.RNA鎖切断反応機構の研究:カビ由来のRNaseでは、His40、Glu58、Arg77、His92が共通に存在し、今までの化学修飾等の結果から触媒残基と推定されている。RNase T_1におけるこれら残基の機能を明らかにするために、His40→Ala、Thr、Asp、Glu58→Ala、Gln、Asp、Arg77→Lys、Thr、His92→Alaの9種類の変換体を作製し、pGpCを基質とし反応速度論的解析を行なった。これらの結果をもとに以下の反応機構を考え出した。『まずArg77が基質のリン酸部分を捕え、基質を結合部位に引き込む。次いでTyr42〜Tyr45のループ部分でグアニン塩基のより精密な認識が成される。切断反応の第一段階は、His40が塩基触媒として基質の2′水酸基からプロトンを引き抜き、同時にHis92は酸触媒として働き、2′、3′環状リン酸体を生成する。第2段階は今とは逆の働きで、環状リン酸体が加水分解される。Glu58は反応の引き金となるHis40の近傍に位置し、その塩基触媒としての役目を高める働きをする。』

報告書

(3件)
  • 1988 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1987 研究成果報告書概要
  • 研究成果

    (33件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (33件)

  • [文献書誌] Morio Ikehara.: Pure & Appl.Chem.59. 965-968 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa.: Biochemistry. 26. 8620-8624 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 西川諭: 日本臨状. 45. 911-919 (1987)

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  • [文献書誌] 西川諭: 生物物理. 27. 119-121 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa.: Biochem.Biophys.Res.Comm.150. 68-74 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa.: Eur.J.Biochem.137. 389-394 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Toshio Hakoshima.: Protein Engineering. 2. 55-61 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 西川諭: 化学と薬学の教室特集号、バイオテクノロジー. 20-26 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 池原森男: 科学. 58. 763-770 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 西川諭: "新しい蛋白質の発見のための遺伝子計画とベクター選択"バイオ高分子研究法1 遺伝子組換えを駆使した蛋白質デザイン"" 学会出版センター, 22 (1987)

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  • [文献書誌] 西川諭: "リボヌクレアーゼT_1"蛋白質工学入門ー新しい蛋白質をつくるー"" 秀潤社, 19 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa.: "Proceedings of the 7th seminar on science and technology "Elucidaton of structure-function relationship of RNase T1 by use of synthetic genes:mechanism of RNA hydrolysis."" 財団法人 交流協会, 15 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Morio Ikehara: "Mechanism of Hydrolysis of Phosphodiesters with Ribonuclease Tl" Pure & Appl. Chem.59. 965-968 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: "Two Histidine Residues Are Essential for Ribonuclease Tl Activity as Is the Case for Ribonuclease A" Biochemistry. 26. 8620-8624 (1987)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: "Protein Engineering of Ribonuclease Tl" Seibutsubutsuri. 27. 119-121 (1987)

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  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: "Glu 46 of Ribonuclease Tl is an Essential Residue for the Recognition of Guanine Base" Biochem. Biophys. Res. Commun.150. 68-74 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: "Increase in Nucleolytic Activity of Ribonuclease Tl by Substitution of Tryptophan 45 for Tyrosine 45" Eur. J. Biochem.137. 389-394 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Toshio Hakoshima: "Conformational Properties of the Guanine-binding Site of Ribonuclease Tl Inferred from the X-ray Structure and Protein Engineering" Protein Engineering. 2. 55-61 (1988)

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      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: Proceedings of the 7th seminar on science and technology "Elucidation of structure-function relationship of RNase Tl by use of synthetic genes: mechanism of RNA hydrolysis.". Interchange Association Japan, 15 (1988)

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    • 関連する報告書
      1988 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: Eur.J.Biochem.137. 389-394 (1988)

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      1988 実績報告書
  • [文献書誌] Toshio Hakoshima: Protein Engineering. 2. 55-61 (1988)

    • 関連する報告書
      1988 実績報告書
  • [文献書誌] 西川諭: 化学と薬学の教室 特集号,バイオテクノロジー. 20-26 (1988)

    • 関連する報告書
      1988 実績報告書
  • [文献書誌] 池原森男: 科学. 58. 763-770 (1988)

    • 関連する報告書
      1988 実績報告書
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: Biochem.Biophys.Res.Comm.150. 68-74 (1988)

    • 関連する報告書
      1988 実績報告書
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: "Proceedings of the 7th seminar on science and technology"Elucidation of structureーfunction relationship of RNase T1 by use of synthetic genes:mechanism of RNA hydrolysis."" 財団法人 交流協会, 15 (1988)

    • 関連する報告書
      1988 実績報告書
  • [文献書誌] Morio Ikehara: Pure & Appl. Chem.59. 965-968 (1987)

    • 関連する報告書
      1987 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: Biochemistry. 26. 8620-8624 (1987)

    • 関連する報告書
      1987 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: Biochem. Biophys. Res. Comm.150. 68-74 (1988)

    • 関連する報告書
      1987 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Satoshi Nishikawa: Eur. J. Biochem.

    • 関連する報告書
      1987 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 西川諭: 日本臨床. 45. 911-919 (1987)

    • 関連する報告書
      1987 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 西川諭: 生物物理. 27. 119-121 (1987)

    • 関連する報告書
      1987 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 西川諭: "新しい蛋白質の発見のための遺伝子計画とベクターの選択"バイオ・高分子研究法1, 遺伝子組換えを駆使した蛋白質デザイン"" 学会出版センター, 22 (1987)

    • 関連する報告書
      1987 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 西川諭: "リボヌクレアーゼT1"蛋白質工学入門-新しい蛋白質をつくる-"" 秀潤社, 19 (1987)

    • 関連する報告書
      1987 研究成果報告書概要

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公開日: 1987-04-01   更新日: 2016-04-21  

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