| 研究課題/領域番号 |
62880019
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| 研究種目 |
試験研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物質生物化学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
長谷 純宏 大阪大学, 理学部, 助教授 (80028232)
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| 研究分担者 |
近藤 昭宏 宝酒造, 薬品研究所, 研究員
加藤 郁之進 宝酒造, 薬品研究所, 所長
池中 徳治 大阪大学, 理学部, 教授 (20028088)
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| 研究期間 (年度) |
1987 – 1988
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| 研究課題ステータス |
完了 (1988年度)
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| 配分額 *注記 |
13,700千円 (直接経費: 13,700千円)
1988年度: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
1987年度: 10,000千円 (直接経費: 10,000千円)
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| キーワード | 蛍光標識 / 糖組成分析 / ピリジルアミノ化 |
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| 研究概要 |
糖蛋白質の糖組成分析を高感度で安定して行う方法として、遊離した単糖をピリジルアミノ化(PA-)し、蛍光性の誘導体として分析する方法が発表されている(武本ら、1985)。しかしこの方法は操作が煩雑なことや、分析に3日間が必要である等自動化には適していない。本研究ではこの反応条件を改良し自動化可能の反応試薬を開発し糖組成分析装置の試作を試みた。
1)揮発性試薬を用いるピリジルアミノ化反応。
従来用いていた-アミノピリジン・Hcl,NaBH┣D23CNの代りに揮発性の-アミノピリジン・酢酸、ジメチルアミン・ボラン錯体を使用した。又これらの反応試薬を用いた時の反応温度、時間、濃度、PH等を検討し、最良条件を見出した。この条件下でピリジルアミノ化した所、中性糖で70%、アミノ糖で87%の収率でピリジルアミノ化された。この条件下で1-10+ノモルの単糖や糖蛋白質の水解物をピリジルアミノ化しHPLCで調べた所、各糖の定量性が見られた。又糖を含まない蛋白質を氷解、N-アセチル化し、ピリジルアミノ化してHPLCで調べた所、ペプチド由来の妨害ピークは認められなかった。
2)減圧にて濃縮乾固する方法を減圧下で窒素気流下で乾固する方法に変えることにより、より効率よく乾固出来た。又この時クライオクールで-80°Cにしたトラップを使用した。
3)従来の逆相HPLCでPA糖を分析する方法から、反応副生成物がピリジアミノ糖と重ならない陰イオン交換樹脂のカラムを恒温槽で温度制御し使用した。
4)1)〜3)で定めた条件を用い自動分析装置を試作し、これを用いて単糖をピリジリアミノ化し、得られたPA-糖をオードサンプラーとデーター処理装置の付いたHPLCで分析した所、1-10+ノモルの範囲で定量性があった。今後N-アセチル化も自動化に組入れる予定である。
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