| 研究課題/領域番号 |
63440088
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| 研究種目 |
一般研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
植物生理学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
安楽 泰宏 東京大学, 理学部, 教授 (20012643)
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| 研究分担者 |
飯田 秀利 基礎生物学研究所, 助手 (70124435)
大矢 禎一 東京大学, 理学部, 助手 (20183767)
中野 明彦 東京大学, 理学部, 講師 (90142140)
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| 研究期間 (年度) |
1988 – 1989
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| 研究課題ステータス |
完了 (1989年度)
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| 配分額 *注記 |
4,100千円 (直接経費: 4,100千円)
1989年度: 4,100千円 (直接経費: 4,100千円)
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| キーワード | カルシウムイオン / 酵母 / 増殖調節 / 顕微分光法 / カルシウム蛍光 / 液胞 / カルモジュリン / α因子 / 細胞内遊離Ca^<2+>濃度 / 細胞増殖 |
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| 研究概要 |
酵母細胞内の遊離Ca^<2+>濃度とその変動をリアルタイムで観測するシステムとして、ニコン蛍光落射顕微鏡マイクロフォ-トFXと浜松ホトニクスARGUS-100を中心とした顕微分光システムを開発した。また、Ca^<2+>特異的蛍光試薬としてfura-2を用い、これを電気パルス法で効率よく酵母細胞内に注入する条件を確立した。この新しい実験方法を用いて、カルシウムイオンによる細胞増殖の調節機構を解析し、以下の成果を得た。1)野生型酵母の細胞内遊離Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)は培地中のCa^<2+>濃度(CaCl_2;1〜100mM)の如何にかかわらず、約100nMに維持されていた。2)液胞はCa^<2+>の細胞内貯蔵オルガネラである。このため液胞を欠失した変異株では[Ca^<2+>]iの定常濃度を維持することができず、Ca^<2+>-感受性になることがわかった。3)酵母を10nM EGTAおよび10μMA23187で処理すると細胞はCa^<2+>欠乏状態となる。この時、[Ca^<2+>]iは10nMのレベルに低下して、細胞は一旦G_1期で増殖を停止するが、その後出芽は停止したままDNA合成はゆるやかに回復してG_2期1M期で完全に停止することがわかった。このことは、Ca^<2+>がDNA合成と出芽を協同的に調節していることを示している。4)性フェロモンα因子の添加により、酵母のa接合型細胞はG_1期に停止し、ついで接合管の形成を開始する。この時、この形態形成のタイムコ-スと平行して、細胞膜のCa^<2+>チャンネルが一過的に開口することを見出した。この結果[Ca^<2+>]iは600〜800nMに上昇すること、この一過的な[Ca^<2+>]iの上昇により、a接合型細胞は細胞死をまぬかれることが明らかになった。5)Ca^<2+>-結合蛋白カルモジュリンの遺伝子の上流にガラクト-スプロモ-タ-を融合した融合遺伝子をプラスミド上に作成し、条件性致死変異株を得た。この変異株を用いて、カルモジュリンが核分裂に必須であることを確証した。
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