| 研究課題/領域番号 |
63480153
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
細菌学
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
寺脇 良郎 信州大学, 医学部, 教授 (10014333)
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| 研究分担者 |
林 哲也 信州大学, 医学部, 助手 (10173014)
伊藤 義文 信州大学, 医学部, 講師 (70135127)
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| 研究期間 (年度) |
1988 – 1989
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| 研究課題ステータス |
完了 (1989年度)
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| 配分額 *注記 |
4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
1989年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1988年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
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| キーワード | プラスミドRts1 / 複製必須蛋白質RepA / DNA結合能 / 異変RepA蛋白質 / 複製開始 / オ-トリプレッサ- / 不和合性 / RepA蛋白 / C末端領域 / 部位特異変異体 / 複製 / 自己制御 / DNA複製 / 複製必須蛋白質 / 変異蛋白質 / 複製開始能 / オートリプレッサー活性 |
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| 研究概要 |
プラスミドRts1の複製必須領域(ミニRts1)にコ-ドされる複製開始蛋白RepA(288アミノ酸残基)について研究を展開した。
1.RepA蛋白の精製とDNA結合実験 repA遺伝子を発現ベクタ-DKK2330-3にクロ-ン化し、IPTGにより誘導した。3種類のカラムを用いて溶菌液よりRepAを精製し、ミニRts1-DNAに対する結合能をDNaseIフットプリント法により解析した。その結果、RepAはincI,incIIくり返し配列およびrepAプロモ-タ-上流に強く結合することが確認された。
2.変異RepA蛋白の機能解析 1)repA中央部への変異の導入:repA遺伝子中央部にあるStyIとXbaI切断部位を利用して、4コのアミノ酸がin frameに挿入された2種類の変異RepAを得た。両者共に複製開始能は失ったが、オ-トプレッサ-/不和合性能は野性型RepAと同程度に保持していた。2)repA3'末端領域への変異の導入:site-derectedmutagenesis法によりrepA遺伝子3'末端に変異を導入した。得られた変異株7種類について機能解析を行った結果、次のことが明らかになった。(1)Lys268は複製開始能とオ-トリプレッサ-/不和合性能の両活性にとり重要である。(2)Arg279は複製開始能のみに関与する。(3)C末端4コのアミノ酸残基を欠失したRepAは複製開始能は亢進したが、これは宿主因子と効率良くinteractできるためと推定される。(4)C末端5コのアミノ酸残基を欠失したRepAは、野性型RepAとほぼ同じ機能を発現した。今後、興味ある機能変化を示したRepA変異蛋白質について、精製し、DNA結合能などを調べる予定である。
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