| 研究課題/領域番号 |
63550725
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
発酵工学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
木下 晋一 大阪大学, 工学部, 助教授 (50029253)
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| 研究分担者 |
関 達治 大阪大学, 工学部, 助教授 (50029245)
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| 研究期間 (年度) |
1988 – 1989
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| 研究課題ステータス |
完了 (1989年度)
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| 配分額 *注記 |
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1989年度: 300千円 (直接経費: 300千円)
1988年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | Sporotrichum cellulophilum / セルラ-ゼ / モノクロ-ナル抗体 / クロ-ニング(セルラ-ゼ) / 多様性(セルラ-ゼ) / 類縁性(セルラ-ゼ) / DNA配列(セルラ-ゼ遺伝子) / アミノ酸配列(セルラ-ゼ) / セルラーゼ / セルラーゼの多様性 / モノクローナル抗体 / セルラーゼ間の類縁性 / セルラーゼの精製 / セルラーゼの修飾 |
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| 研究概要 |
S.cellulophilumからセルラ-ゼCII1、CII2、CIII1、CIII2、CIII3、CIVを精製し、CIII2と、CIVは糖鎖を除去した。これらからモノクロ-ナル抗体を調整したが、4つしか得られなかった。これらの抗体と精製酵素との反応性をELISA法で調べた結果、セルラ-ゼCIVはCIII2と最も近縁で、次にCIII1で、さらにCIII3とCII1で、CII2は殆ど関連性がなかった。
セルラ-ゼCIVのN末アミノ酸配列を決定しようとしたが、ブロックされていたので、リジルエンドペプチダ-ゼで切断後、HPLCで分離し、2つの断片のアミノ酸配列を22残基と31残基決定した。これらの配列に基づいて14〜29bの8種のDNAプロ-ブを合成した。常他によりS.cellulophilumからRNAを抽出し、cDNAライブラリ-を作成した。これをプロ-ブT(20b)でスクリ-ニングし、強くハイブリダイズするクロ-ンを得た。これからDNAを抽出し、プロ-ブC(23b)でハイブリダイズさせたが成功しなかった。
上の方法はcDNAの調整の効率が悪かったので糸状菌からDNAを抽出し、SauIIIA1で切断し、DNAライブラリ-を作成した。これをプロ-ブB(23b)で検索し、4.9kbp断片を得た。これを種々な制限酵素で小分子化し、400bpのAlu1-Alu1がプロ-ブと強く反応することを確認し、塩基配列を常法によって決定したが、アミノ酸配列と一致する部分は検出されなかった。次にプロ-ブD(29b)を用いて同様な方法で500bpのSmal-Kpnl断片と1050bのEcoT22I-Xbal断片を分離し、DNA配列を決定した結果、それぞれ7と6個のアミノ酸残基の配列がセルラ-ゼのものと一致したが、それらの前後数百塩基からはセルラ-ゼのアミノ酸配列に相当する部分は見付けられなかった。
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