| 研究課題/領域番号 |
63560107
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・発酵学
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
加藤 暢夫 鳥取大学, 工学部, 教授 (50026556)
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| 研究期間 (年度) |
1988 – 1989
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| 研究課題ステータス |
完了 (1989年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1989年度: 400千円 (直接経費: 400千円)
1988年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
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| キーワード | ホルムアルデヒドジスムタ-ゼ / Pseudomonas putida / NAD(H) / クロ-ニング / 不均化反応 / ホルムアルデヒド / ホルムアルデヒドジスムターゼ / クローニング |
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| 研究概要 |
Pseudomonas Putida F61に見出したホルムアルデヒドジスムタ-ゼ(FDM)は、アルデヒドの不均化、異種アルデヒドの交叉不均化、およびアルコ-ルとアルデヒドの分子種を交換するアルコ-ル:アルデヒド酸化還元反応を触媒する新しい型の酵素である。この酵素の活性中心にはNAD(H)が非共有結合的に強く結合しており、NAD(H)は酵素に結合したままで酸化・還元され、その結果2種の基質の酸化と還元が同時に起こる。本研究では、この酵素タンパク質とNAD(H)との高い親和性をタンパク質化学的に明らかにすることを目的とし、酵素タンパク質のNAD(H)保持の機構をタンパク質の一次構造から類推するために必要なFDM遺伝子のフロ-ニングを行った。
FDM遺伝子のフロ-ニングにはF61株の全ゲノムを対象としたショットガン法を適用し、宿主ベクタ-系としてPseudomonas putida TN1126とPKT230系を用いた。組換え株のスクリ-ニングには、精製酵素より調製した抗体を用いる免疫学的方法を考案した。組換え株約20,000株より、FDM活性が親株の約1/100のものを得、そのプラスミドをサブクロ-ニングし、DEC5を得た。また同じDNA断片をPUC19に挿入したPEC21を得た。PEC5およびPEC21でそれぞれ形質転換したTN1126株およびJM109株では、ウェスタンブロット法でFDMタンパク質の合成は認められたものの、JM109/PEC21は活性を示さなかった。TN1126/PEC5の無細胞抽出液よりFDMタンパク質を電気泳動的に均一なまでに精製した。精製酵素はHPLCおよびSDS-PAGEで親株F61の酵素とまったく同一の挙動を示したが、比活性はF61の酵素の約1/100で、NAD(H)含量は約1/50であった。またF61株のFDM^-株を宿主菌としてPEC5を形質転換した場合には高いFDM活性を示した。FDMのNー末端アミノ酸配列を参考にして調製したオリゴスクレオチドプロ-ブを用い多数のクロ-ンを得、塩基配列を決定している。
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