| 研究課題/領域番号 |
63570137
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
病態医化学
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| 研究機関 | 国立循環器病センター |
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研究代表者 |
三宅 可浩 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 部長 (40028353)
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| 研究分担者 |
宮野 元成 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 研究員 (40166187)
井上 裕康 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 研究員 (40183743)
桃井 京子 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 研究員 (90174359)
福井 清 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 室長 (00175564)
渡辺 房男 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 研究員 (40183719)
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| 研究期間 (年度) |
1988 – 1990
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| 研究課題ステータス |
完了 (1990年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1990年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
1989年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1988年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | Dーアミノ酸オキシダ-ゼ / レニン結合蛋白質 / 相補的DNA / 遺伝子発現調節 / 部位特異的変異誘発 / ロイシンジッパ-構造 / 組換体蛋白質発現 / 組換体変異蛋白質 / 相補的DNA塩基配列 / 遺伝子発現 / 翻訳調節 / 変異体蛋白質精製 / 変異体蛋白質機能異常 / 遺伝子構造解析 / 大量発現と精製 / 遺伝子発現機構 / 部位特異的突然変異誘導体 / D-アミノ酸オキシダーゼ / 部位特異的変異誘導 / DNAライブラリー / 発現の組織特異性 |
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| 研究概要 |
腎臓にあって、体液調節、血圧調節に関与することが示唆されているレニン結合蛋白質(RnBP)及びDーアミノ酸オキシダ-ゼ(DAO)について、遺伝子構造の決定、遺伝子発現、試験管内及びアフリカツメ蛙卵細胞による組換え蛋白質の発現を行い、さらに、部位特異的変異誘発による組換え変異体蛋白質の作成による機能異常や、遺伝子発現調節の解析を行った。RnBPについては、ブタ及びラット腎臓、ヒト腫瘍細胞のcDNAライブラリ-から、それぞれの RnBP cDNAを単離し、塩基配列を決定した。
コ-ドされているRnBPの一次構造は相互に約80%の相同性を有し、また、構造上の特徴として、一次構造中に1ケ所、高い疎水性領域とそれに続くロイシンジッパ-構造が認められ、3種動物のRnBPでよく保存されていた。ロイシンジッパ-構造の2ロイシン残基をアスパラギン酸に置換した組換え変異体をブタRnBPについて発現させ、その機能を解析した結果、本蛋白質のもつレニンとの複合体形成、レニン活性の阻害、RnBP二量体形成の各機能が消失していることが見出され、ロイシンジッパ-構造がこれら機能に関与することが判明した。DAOについては、ヒト、ウサギ、マウス腎臓のDAO cDNAを単離し、塩基配列を決定した。すでに得ているブタDAO cDNAを含めて、コ-ドされているアミノ酸配列を比較した結果、相互に約80%の高い相同性が認められた。しかし、発現、精製したヒト、ウサギ、マウスの組換体DAOの基質親和性及び比活性はブタDAOに比して著しく低く、また、ウサギDAOの遺伝子発現過程で強い翻訳抑制が認められたが、他のDAOでは認められず、遺伝子発現から蛋白機能まで、動物種間の多陽性が示された。また、疾患モデルとして、単アミノ酸置換組換え変異体DAO(Tyrー228→Phe,Hisー307→Leu)2種を作成した。これらの変異体は著しく低い比活性を示し、これら2アミノ酸残基の機能発現上の重要性が示唆された。
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