ネズミ糞線虫排泄・分泌液中の防御免疫誘導成分の精製と同定

• 研究課題/領域番号: 63570178
• 研究種目: 一般研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 寄生虫学
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 多田 功 熊本大学, 医学部, 教授 (60064531)
• 研究分担者: 是永 正敬 熊本大学, 医学部, 助手 (00128274)
• 研究期間 (年度): 1988
• 研究課題ステータス: 完了 (1988年度)
• 配分額: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 1988年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
• キーワード: ネズミ糞線虫 / 排泄・分泌抗原 / 特異抗体産生 / SDS-PAGE / ELISA / 免疫プラーク法

研究概要

感染ラット小腸より回収したネズミ糞線虫成虫を数回無菌生理的食塩水にて洗浄後、高濃度のストレプトマイシン・ペニシリン液にて滅菌し、1%グルコースを含むRPMI1640培地にて5%CO_2/air、37℃で培養した。培養上清をミリポアフィルターにて濾過し、これを排泄分泌(ES)抗原として用いた。酵素抗体法(ELISA)に用いる場合は炭酸バッファーにて透析、また濃縮する場合は、蒸留水にて透析後、凍結乾燥を行なった。抗原性をテストするために、感染型幼虫(L_3)、成虫(Ad)、成虫のESの各抗原溶液(10μg/ml)をマイクロタイタープレートに感作し、感染後30〜40日目のラット血清のIgG抗体価を測定した。ES抗原では5000倍の力価を示したが、Ad抗原、L_3抗原ではそれぞれ1200倍、5倍であった。限外濾過によってES抗原を分子量30Kで分け、同様にELISA法でどちらの分画に活性があるか調べてみると、分子量30K以上の分画に抗原活性が含まれていることがわかった。更にES抗原を含む溶液にて血清を希釈した競合ELISA法でAd抗原の活性をみると、血清希釈80〜160倍では約50%もの活性の減少がみられた。このことはAd抗原性のかなりの部分がES抗原に依存していることを示唆している。還元型SDSポリアクリルアミド電気泳動法による蛋白質の分析から、ES抗原では分子量45Kから80Kにかけて7本のバンドが認められた。ES抗原を感作したニトロセルロース膜を用いてフィルター免疫プラーク法で、ES抗原特異的IgG抗体産生細胞の動態を追究した。感染後経時的にラットを剖検し、腸間膜リンパ節を採取し、10^6個当りの抗体産生細胞数を計測した。感染後6日目までは正常対照と同じであったが、それ以降、急速に抗体産生細胞が出現し、13日目にピークに達した。その後、漸減したが49日目でも抗体産生細胞が観察された。この抗体産生細胞数の増加と排虫開始時期は一致しており、成虫の排除にES抗原特異抗体が関与していることが強く示唆された。