| 研究課題/領域番号 |
63570195
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
細菌学
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
古賀 哲郎 徳島大学, 医学部, 助手 (20093859)
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| 研究分担者 |
大和 正幸 徳島大学, 医学部, 助手 (90210492)
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| 研究期間 (年度) |
1988 – 1989
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| 研究課題ステータス |
完了 (1989年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1989年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1988年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | ラクトバシラス属 / 規則的配列構造 / gene library / 免疫スクリ-ニング / 免疫ブロット |
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| 研究概要 |
1.Lactobcillus acidophilusは生化学的、生物学的性状が不均質な菌株の集団よりなっておりその分類は非常に混乱している。我々は従来行われているDNA相同性に基く分類の他に規則的配列構造(RA)蛋白の性状がこの菌株の分類に利用できる可能性を示した。すなわちRAを産生するのはDNA相同性で分類されたA群の菌のみであり、他の菌群はRAを産生しない。またA-1亜群のRA蛋白の分子量、ペプチドマップはすべての菌株で同じであり、また免疫学的にも高い均質性を示した。しかし、A-2、A-3、A-4亜群のRA蛋白の分子量、ペプチドマップは異質性を示した。Aー2亜群RAは免疫学的にかなり均質であるが、Aー3亜群RA蛋白は免疫学的に不均質であり、またAー4亜群RA蛋白抗体はA-3亜群の1株と交差反応を示すなどA-3、A-4亜群菌株はRA蛋白の性状によってさらに細かく分類する必要があることがわかった。
2.L.brevis ATCC8237の染色体DNAをEcoRIで部分消化し、その3〜9kb断片をλgt11のEco RI siteに挿入したのち、in vitro packagingを行ってgene libraryを得た。ウサギ抗RA蛋白抗体を用いてこのlibraryの免疫screeningを行うと2638個のプラック中16個が陽性であった。抗体反応陽性を示した10個のphage lysateをWestern blotで調べると7個のphage lysateは130kDaより大きい分子量のfusion蛋白、3個はそれよりちいさいfusion蛋白として免疫反応陽性を示した。前者phage(phage 3a)DNAには約2.4kb、後者のphage(phage 3b)DNAには、約3.2kbのEcoRI断片が挿入されていた。Phage 3aDNAの2.4kb断片をpUC19のEcoRI siteに挿入し、E.coli JM109株に形質転換した。
このplasmid(pLB1)をもつ菌の音波処理液をWestern blotするとRA蛋白と同じ位置(51kDa)に抗RA蛋白抗体と反応するバンドが認められこの2.4kb断片にはRA蛋白をコ-ドする遺伝子が含まれることが示された。このplB1のdeletion mutantを作成し、塩基配列の決定を試みている。
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