| 研究課題/領域番号 |
63580154
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
代謝生物化学
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
池田 己喜子 岡山大学, 薬学部, 講師 (20112154)
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| 研究分担者 |
坪井 誠二 岡山大学, 薬学部, 助手 (50172052)
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| 研究期間 (年度) |
1988
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| 研究課題ステータス |
完了 (1988年度)
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| 配分額 *注記 |
1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
1988年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
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| キーワード | カサノリ / CL^-輸送ATPase / E-P-(CL^-)complex / ヌクレオチド結合部位 / a-subunit / リジン残基 / CL^-ポンプ活性 / アルギニン残基 |
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| 研究概要 |
1)CL^-輸送ATPaseの触媒部位の同定:カサノリ膜画分より可溶化・精製したCL^-輸送ATPaseを〔γ-^<32>P〕ATPと5分間incubateし、Enzyme-phosphate complex生成の有無を調べた結果、coldATPによってchaseを受け、又、hydroxyl-amine処理により分解するaspartyl phosphate (P-type ATPaseに特異的)型の中間体を生成する事が明らかとなった。又、┣D136CL┣D1-┫D1を用い、ATP存在下及び非存在下で精製したCL┣D1-┫D1輸送ATPaseとincubateした結果、ATP存在下に┣D136CL┣D1-┫D1結合の増加がみられた。この事は、Enzyme-phosphate-CL┣D1-┫D1 complexの生成を示唆するものと考えられる。
2)CL^-輸送ATPaseのヌクレオチド結合部位の検索:数種の特異的アミノ酸修飾試薬を用い、ATPase活性に及ぼす影響を調べた。その結果、リジン残基を特異的に修飾するadenosine triphosphopyridoxal(AP_3-PL)により顕著な活性阻害及びATPによる保護効果が認められた。トリプトファン残基に特異的なNBD-CL並びにアルギニン残基に特異的なフェニルグリオキサールは、ATPase活性阻害効果をほとんど示さなかった。又、^<3H>-AP_3-PLを用い、修飾後、SDS-PAGEを行い、染色・脱色後、各a-及びb-subunitを切り取り、15%H_2O_2で溶解し、液体シンケレーションカウンターで計測した結果、a-subunitに大部分の放射活性が検出された。この事は、CL^-輸送ATPaseの構成subunitのうち、a-subunitにヌクレオチド結合部位が存在する事を支持するものである。
3)再構成系におけるCL^-輸送活性:リポソーム調製脂質として正の荷電を有するものは不適当で輸送活性は認められなかった。リポソーム内から外へ^<36CL>^-のはき出しは、ATPase活性阻害剤であるazide添加により90%程度の阻害を受けた。又、アルギニン残基の修飾により輸送活性は認められなくなった。リポソーム内のアニオンを^<35>SO^<2->_4に置き換えるとポンプ活性はほとんど認められなくなった。
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