| 研究課題/領域番号 |
63870002
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| 研究種目 |
試験研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
解剖学一般
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| 研究機関 | 慶応義塾大学 |
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研究代表者 |
安田 健次郎 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (90050327)
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| 研究分担者 |
平岡 芳樹 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80218768)
塩沢 昌英 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (50170840)
相磯 貞和 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (60138013)
山下 修二 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (90050666)
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| 研究期間 (年度) |
1988 – 1989
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| 研究課題ステータス |
完了 (1989年度)
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| 配分額 *注記 |
7,200千円 (直接経費: 7,200千円)
1989年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1988年度: 6,300千円 (直接経費: 6,300千円)
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| キーワード | in situ hybridization / γ-GTP / in vitro transcription / Northern hybridization / γ-glutamyl transpeptidase / ノザンハイブリダイゼーション |
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| 研究概要 |
我々は細胞における直接的な蛋白質の産生を証明するため、抗体を用いる免疫組織化学的方法と組織切片上でmRNAに相補的なDNAもしくはRNAをプロ-ブとしてハイブリダイズさせるin situ hybridization法を用いて、物質の局在を明らかにするアプロ-チを試みた。
1.mRNA量の検定
ヒトγGTPのcDNAクロ-ンを用いてヒト胎児肝のmRNAの検出感度をノザンハイブリダイゼ-ションにより検討したところ、胎齢12週ですでにその発現を認め、胎齢の増加と共にその発現は増加し、胎齢40週でピ-クとなった。この傾向は免疫組織化学反応による蛋白レベルでの結果と一致する。得られたmRNAのサイズは2.7kbである。
2.ラベリングの方法
ISH法を行うためには非特異結合を防ぎ検出感度の優れた方法を用いなければならない。そこでRNAプロ-ブとDNAプロ-ブの検出感度を比較したところ、RNAプロ-ブでは2μgのpolyA^+ RNAに対して6時間のオ-トラジオグラフィ-でbandを検出できたが、DNAプロ-ブでは2over night以上の露光時間が必要であった。
3.in situ hybridization
ヒト胎児肝を4%パラホルムアルデヒド固定後、OCT compoundに包埋、凍結後、薄切する。0.2NHClに5min浸漬した後、37℃でProteinaseKを15min処理する。上記条件でRNAプロ-ブを用いて、37℃でPrehybridize、次いでHybridizeしたところ、antisenseRNAに反応がみられたが、senseRNAにおいても弱いながらも非特異的反応が認められた。反応に用いたのはビオチン化プロ-ブである。
現在、この非特異反応を抑えるため、hybridizeさせる温度を上昇させると共に、アイソト-プによる標識も検索中である。
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