| 研究領域 | ユビキチンネオバイオロジー：拡大するタンパク質制御システム |
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| 研究課題/領域番号 |
15H01186
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
弓本 佳苗 九州大学, 生体防御医学研究所, 特任助教 (30596838)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2016年度)
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| 配分額 *注記 |
9,620千円 (直接経費: 7,400千円、間接経費: 2,220千円)
2016年度: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)
2015年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
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| キーワード | ユビキチンリガーゼ / Keap1 / ユビキチン / プロテオミクス / 基質 / CRISPR/Cas9 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題ではユビキチンリガーゼ(E3)の基質を生理的条件下で包括的に同定する研究基盤の構築を目標とした。前年度はKeap1-Nrf2をベンチマークに系を確立した。本年度はほとんど基質がわかっていないユビキチンリガーゼであるUBR1-7について系を応用することを目標とした。本系では、ユビキチン化活性を喪失させたE3変異体を導入する必要があるが、最初に、どのような変異を入れることが必要か検証をおこなった。UBRsについてRINGドメイン欠損変異体もしくはRINGドメインの機能を欠損させるような点変異体を作製し、ユビキチンと共に細胞内に過剰発現させ、E3の自己ユビキチン化を指標に変異体のユビキチン化活性の低下を確認した。
次にUBRs7のN末端に相同組み換えによってFLAGタグを挿入し、かつ開始コドンの次のイントロンにHygromycin耐性遺伝子を挿入するような組み換えベクターを設計、構築した。また、開始コドンをまたぐようにguide RNAを設計した。これらのベクターをHEK293TもしくはHCT116細胞に導入し、UBRsのN末端にFLAGタグが挿入された細胞を得た。
前年度の研究課題に際し、Keap1-Nrf2の系を構築する過程で、われわれはKeap1のE3機能が他のCul3型E3と比較して著しく弱いことを発見した。これはKeap1のBTBドメインが特殊な形状をしているためであり、強いE3活性を持つKLHL3のBTBドメインとのスワップ変異体を作製することで、E3の機能回復が確認できた。CRISPR/Cas9システムを用いてスワップ変異体をノックインした細胞では、ストレス応答におけるNrf2の蓄積および下流の遺伝子の応答が遅延した。以上よりKeap1の「弱い」E3活性は迅速なストレス応答のために最適化されていることが推測される。
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| 現在までの達成度 (段落) |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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