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1分子超解像観察による、一次シリア基底部の分子選択的拡散障壁機構の解明

公募研究

研究領域シリア・中心体系による生体情報フローの制御
研究課題/領域番号 15H01212
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 生物系
研究機関京都大学

研究代表者

藤原 敬宏  京都大学, 物質-細胞統合システム拠点, 特定拠点准教授 (80423060)

研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2017-03-31
研究課題ステータス 完了 (2016年度)
配分額 *注記
10,920千円 (直接経費: 8,400千円、間接経費: 2,520千円)
2016年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
2015年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
キーワード一次シリア / 拡散運動 / 1分子計測 / 3次元追跡 / 超解像 / 細胞膜
研究実績の概要

本研究は、一次シリアを細胞体から隔てている境界構造の分子構築と、その構造が拡散障壁として、しかも、特定の分子の選択的な出入りを決めるフィルターとしてはたらく機構の解明を目的とする。そのために、生細胞超解像-高速1蛍光分子同時観察顕微鏡システムの3次元拡張をおこない、一次シリア基底部の構造(細胞膜の配向)を3次元的に把握しながら、拡散障壁構成分子の超解像観察、および、シリア局在分子/非局在分子の1分子追跡をおこない、基底部での出入りを調べることを目指した。昨年度に3次元拡張を完了した生細胞超解像-高速1蛍光分子同時観察顕微鏡システムをもちいて、本年度は以下の研究進捗があった。
(1) 一次シリアの3次元生細胞超解像観察
光変換型の蛍光タンパク質超解像プローブ (mEos3.2) で一次シリアマーカー分子 (Smoothened) を標識し、一次シリア全体の3次元超解像構造を約30秒間観察できるようになった。
(2) 一次シリア局在分子 (セロトニン受容体6) の3次元1分子追跡
一次シリア基底部と先端部の位置を超解像観察で3次元的に把握しながら、一次シリア細胞膜上の蛍光 (SeTau647) 標識したセロトニン受容体6(Gタンパク質共役型受容体)を、時間分解能16.7ミリ秒 (60フレーム/秒) で、退色するまでの10-30秒にわたって1分子追跡することが可能になった。セロトニン受容体は、基底部で1秒以下の短時間の停留を頻繁に示したが、30秒の観察時間中に、細胞膜上の拡散で一次シリア外部に出ていくことはなかった。露光時間16.7ミリ秒、サンプリングレート4フレーム/秒で、5分間のタイムラプス長時間観察をおこなったところ、細胞内部から基底部に向けた/基底部から細胞内部に向けた、小胞輸送が活発に起こり、セロトニン受容体を含む小胞が基底部近傍に蓄積していることが明らかになった。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2016 実績報告書
  • 2015 実績報告書
  • 研究成果

    (8件)

すべて 2017 2016 2015

すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 2件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 3件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 3件、 招待講演 5件)

  • [雑誌論文] Confined diffusion of transmembrane proteins and lipids induced by the same actin meshwork lining the plasma membrane2016

    • 著者名/発表者名
      T. K. Fujiwara, Iwasawa, K., Kalay, Z., Tsunoyama, T. A. Y. Watanabe, Y. M. Umemura, H. Murakoshi, K. G. N. Suzuki, Y. L., Nemoto, N. Morone, A. Kusumi
    • 雑誌名

      Mol. Cell Biol.

      巻: 27 号: 7 ページ: 1101-1119

    • DOI

      10.1091/mbc.e15-04-0186

    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Raft-based interactions of gangliosides with a GPI-anchored receptor2016

    • 著者名/発表者名
      N. Komura, K. G. N. Suzuki, H. Ando, M. Konishi, M. Koikeda, A. Imamura, R. Chadda, T. K. Fujiwara, H. Tsuboi, R. Sheng, W. Cho, K. Furukawa, K. Furukawa, Y. Yamauchi, H. Ishida, A. Kusumi (Co-Corresponding Author), and M. Kiso
    • 雑誌名

      Nat. Chem. Biol.

      巻: in press 号: 6 ページ: 402-410

    • DOI

      10.1038/nchembio.2059

    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Selective Labeling of Proteins on Living Cell Membranes Using Fluorescent Nanodiamond Probes.2016

    • 著者名/発表者名
      Shingo Sotoma, Jun Iimura, Ryuji Igarashi, Koichiro M. Hirosawa, Hidenori Ohnishi, Shin Mizukami, Kazuya Kikuchi, Takahiro K. Fujiwara, Masahiro Shirakawa and Hidehito Tochio
    • 雑誌名

      Nanomaterials

      巻: 6 号: 4 ページ: 56-56

    • DOI

      10.3390/nano6040056

    • NAID

      120005848250

    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Revealing plasma membrane compartmentalization and function: an ultrafast single-molecule imaging study2017

    • 著者名/発表者名
      Takahiro Fujiwara
    • 学会等名
      The UK-Japan Spring Neuroscience Symposium
    • 発表場所
      Kyoto, Japan
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Revealing plasma membrane organization by developing high-speed single-molecule imaging methods2016

    • 著者名/発表者名
      藤原敬宏
    • 学会等名
      CREST 永井チーム・ワークショップ 『超解像「生理機能」イメージング法の開発と細胞状態解析への応用』
    • 発表場所
      沖縄科学技術大学院大学
    • 年月日
      2016-07-27
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Plasma membrane compartmentalization and function as revealed by ultrafast single fluorescent-molecule imaging2015

    • 著者名/発表者名
      Takahiro Fujiwara
    • 学会等名
      Cold Spring Harbor Asia Conferences on New Advances in Optical Imaging of Live Cells and Organisms
    • 発表場所
      Suzhou, China
    • 年月日
      2015-12-07
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 1分子局在超解像法による細胞内動態の理解に向けて2015

    • 著者名/発表者名
      藤原敬宏
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会第71回学術講演会
    • 発表場所
      国立京都国際会館
    • 年月日
      2015-05-13
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Revealing plasma membrane compartmentalization and function by developing ultrafast single-molecule imaging techniques2015

    • 著者名/発表者名
      Takahiro Fujiwara
    • 学会等名
      The 9th Asian Biophysics Association Symposium
    • 発表場所
      Hangzhou, China
    • 年月日
      2015-05-09
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演

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公開日: 2015-04-16   更新日: 2018-03-28  

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