| 研究領域 | 運動超分子マシナリーが織りなす調和と多様性 |
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| 研究課題/領域番号 |
15H01313
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
須河 光弘 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (80626383)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2016年度)
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| 配分額 *注記 |
3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
2016年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2015年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
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| キーワード | 細胞骨格 / 構造機能相関 / FRET / 偏光 / アクチン / 偏光計測 / 構造ダイナミクス / 1分子計測 |
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| 研究実績の概要 |
細胞活動に重要なアクチンフィラメントの内部構造の変化を単分子レベルで捉えることを目指し、FRETの偏光依存性を利用した計測法（偏光FRET法）の開発を進めている。偏光FRET法であれば、たとえ溶液中を回転拡散している生体分子であっても、その内部構造の変化（主に角度変化）を高感度で捉えられる。この偏光FRET法を実現するためにはタンパク質の部位特異的に修飾するためにシステイン反応性のmaleimide基を持つbifunctional dyeが必要となる。そこで市販されているCy3-bis-NHSおよびCy5-bis-NHSを改変し、２つのmaleimide基を持つCy3-bis-maleimideおよびCy5-bis-maleimideを合成した。次に、これら合成した２種類のbifunctional dyeをアクチンへ部位特異的に修飾するために４箇所のシステイン変異を導入したテトラシステイン変異体アクチンを用意した。HEK293細胞の発現系にてテトラシステイン変異体を発現・精製し、２種のbifunctional dyeで蛍光修飾を試みた。当初作成したテトラシステイン変異体ではbifunctional dyeによるアクチン同士の架橋が起きたため再度変異部位を検討し、新たに作成したテトラシステイン変異体では蛍光色素による架橋を大幅に減らすことができた。蛍光修飾アクチンにて１分子FRETイメージングを行いFRETが起きていること、また天然型アクチンとの混合ではあるが重合能も確認している。しかし、この精製段階の蛍光修飾アクチンにはドナーしかもたないアクチンも含まれている。ドナーしかもたないアクチンはFRETイメージングのバックグラウンドになるため、さらに精製を行うことで検出感度の向上を目指す。
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| 現在までの達成度 (段落) |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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