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アーキアの転写装置を利用した多段階転写反応の動的メカニズムの解明

公募研究

研究領域高精細アプローチで迫る転写サイクル機構の統一的理解
研究課題/領域番号 15H01357
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 生物系
研究機関愛媛大学

研究代表者

平田 章  愛媛大学, 理工学研究科(工学系), 講師 (60527381)

研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2017-03-31
研究課題ステータス 完了 (2016年度)
配分額 *注記
11,570千円 (直接経費: 8,900千円、間接経費: 2,670千円)
2016年度: 5,720千円 (直接経費: 4,400千円、間接経費: 1,320千円)
2015年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
キーワードRNAポリメラーゼ / 転写開始前複合体 / アーキア / 転写活性化因子 / X線結晶構造解析 / 電子顕微鏡 / 転写
研究実績の概要

本年度は、極低温電子顕微鏡による単粒子解析を行うために、アーキアRNAポリメラーゼ(RNAP)とRNAPを含む転写活性化型開始前複合体の調製を行なった。アーキアの基本転写因子TBPとTFB、転写促進因子TFEおよび転写活性化因子Tarの4種類のタンパク質を大腸菌発現系を用いて大量に発現させ、カラムクロマトグラフィーにより精製した。アーキアRNAPは、Thermococcus kodakarensisの培養菌体から抽出・精製した。各タンパク質をTar認識配列およびプロモーター領域を含む二本鎖合成DNAに加え、70℃でインキュベート後、混合溶液をゲル濾過クロマトグラフィーにより、転写活性化型開始前複合体を調製した。アーキアRNAP単独のネガティブステイン解析では、外形構造が電子顕微鏡により明らかになっているが、現在、複合体は解析中である。一方、TarとDNA複合体の共結晶を調製するために、結晶化ロボットを用いて、結晶化条件を検討した。その結果、一塩基突出した二本鎖DNAを用いた場合、Tar-DNA複合体の良質な結晶を得ることに成功し、ある有機溶媒系の沈澱化剤が結晶化に最適であることも分かった。Tar-DNA複合体結晶のX線回折を実験室レベルで確認したところ、2.5 オングストローム分解能であった。今後は、放射光施設で高分解能のTar-DNA複合体のX線結晶構造を決定し、Tarの転写活性化機構を解明する。もう一つの転写活性化因子である原核生物RcdAのDNA認識機構について解明することに成功し、DNA認識に重要なアミノ酸を同定することができた。RcdAの研究成果を国際的な学術雑誌に投稿中である。さらに、計画斑である大阪大学の中村先生らとMD解析により、アーキアRNAPのクランプとストークの連動に二つのサブユニットRpb3とRpb11が重要な構造変化をしていることを見出した。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2016 実績報告書
  • 2015 実績報告書
  • 研究成果

    (3件)

すべて 2016 2015

すべて 学会発表 (3件) (うち国際学会 1件)

  • [学会発表] Insights derived from Molecular Dynamics Simulations into the subunit assembly and clamp motions of Thermococcus kodakarensis RNA polymerase2016

    • 著者名/発表者名
      Mohan A, Kasahara, K, Hirata A and Nakamura H
    • 学会等名
      第16回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      福岡国際会議場 (福岡県福岡市博多区)
    • 年月日
      2016-06-07
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] X-ray crystal structure of euryarchaeal RNA polymerase (RNAP) from a hyperthermophilic archaeonThermococcus kodakarensis: Insights into the molecular evolution of the archaeal/eukaryotic RNAP and molecular mechanism underlying the clamp-open state in the presence of the stalk2015

    • 著者名/発表者名
      平田 章、Sung-Hoon Jun、金井 保、Thomas J Santangelo、今中 忠行、村上 勝彦
    • 学会等名
      Thermophiles2015
    • 発表場所
      サンティアゴ大学(チリ共和国サンティアゴ)
    • 年月日
      2015-08-30
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 転写制御に関わるアーキア及び真核生物 RNAポリメラーゼのクランプ構造の開閉機構2015

    • 著者名/発表者名
      平田 章、Sung-Hoon Jun、金井 保、Thomas J Santangelo、今中 忠行、村上 勝彦
    • 学会等名
      第15回日本蛋白質学会年会
    • 発表場所
      あわぎんホール (徳島県徳島市)
    • 年月日
      2015-06-24
    • 関連する報告書
      2015 実績報告書

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公開日: 2015-04-16   更新日: 2018-03-28  

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