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リポソーム内膜タンパク質発現系の発現ダイナミクス制御技術の確立と応用

公募研究

研究領域生命分子システムにおける動的秩序形成と高次機能発現
研究課題/領域番号 16H00767
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 理工系
研究機関大阪大学

研究代表者

松浦 友亮  大阪大学, 工学研究科, 准教授 (50362653)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2018-03-31
研究課題ステータス 完了 (2017年度)
配分額 *注記
6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)
2017年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
2016年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
キーワード無細胞翻訳系 / リポソーム / アゾベンゼン / 光制御 / バイオテクノロジー / 人工細胞 / 膜タンパク質 / 生物物理
研究実績の概要

我々は、細胞サイズのリポソーム内で再構成型無細胞翻訳系PURE systemを用いて膜タンパク質を合成する技術を確立してきた。リポソームディスプレイ法と名付けたこの技術は、膜タンパク質の進化分子工学だけでなく、細胞環境に近い反応場での膜タンパク質の機能解析を可能とする。
生体膜上での高次の生命現象の多くは、発現のダイナミクスが制御された複数種の膜タンパク質が協同的に働くことで進行する。現行のリポソームディスプレイ法は、複数種の膜タンパク質を発現させることは可能だが、各タンパク質の発現のタイミングを制御できない。そこで本研究では、光によって異性化するアゾベンゼン2,6-dimethylazobenzene-4’-carboxylic acid (DM-Azo)と2,6-dimethyl-4-(methylthio)azobenzene-4′-carobxylic acid (S-DM-Azo)を導入したオリゴDNAを用いる事でリポソーム内膜タンパク質合成反応のダイナミクスを制御する技術の確立とその応用を目指した。
まず、緑色蛍光タンパク質(GFP)をモデルタンパク質として用い、その発現の光制御技術の確立を行った。オリゴDNA配列をGFP遺伝子の開始コドン付近に会合し、リボソームによる翻訳反応を阻害するようデザインした。その結果、DM-Azoを用いたオリゴDNAのほうがS-DM-Azoよりも合成反応を効率的に停止させる事、オリゴへの適切なDM-Azo挿入位置を明らかにした。次に、上記の情報を用いて膜タンパク質の膜透過装置Secトランスロコンとモデル膜タンパク質である大腸菌由来多剤排出トランスポーターEmrEの発現の制御を試みた。SecトランスロコンとEmrEを両方同時に合成し、光照射によりSecトランスロコンの翻訳のみを停止させる事に成功した。リポソーム内で、この反応を実施する事により、Secトランスロコンの存在下に於いてEmrEを合成すること、すなわち細胞模擬環境が実現可能となる。

現在までの達成度 (段落)

29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

29年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2017 実績報告書
  • 2016 実績報告書
  • 研究成果

    (10件)

すべて 2018 2017 2016 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (6件) (うち国際学会 2件、 招待講演 6件)

  • [国際共同研究] Stanford University/University of Washington(米国)

    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [雑誌論文] Concurrent In Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential2018

    • 著者名/発表者名
      Iwamoto M, Elfaramawy MA, Yamatake M, Matsuura T, Oiki S
    • 雑誌名

      ACS Synthetic Biology

      巻: 7 号: 4 ページ: 1004-1011

    • DOI

      10.1021/acssynbio.7b00454

    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Reaction dynamics analysis of a reconstituted Escherichia coli protein translation system by computational modeling2017

    • 著者名/発表者名
      Matsuura, T., Tanimura, N., Hosoda, K., Yomo, T., and Shimizu, Y.
    • 雑誌名

      Proc Natl Acad Sci U S A

      巻: 114 号: 8

    • DOI

      10.1073/pnas.1615351114

    • 関連する報告書
      2017 実績報告書 2016 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] In vitro membrane protein synthesis inside Sec translocon-reconstituted cell-sized liposomes2016

    • 著者名/発表者名
      Ohta, N., Kato, Y., Watanabe, H., Mori, H., and *Matsuura, T
    • 雑誌名

      Sci Rep

      巻: 6 号: 1 ページ: 36252-36252

    • DOI

      10.1038/srep36466

    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 再構成型セルフリータンパク質合成系を用いたタンパク質配列空間と成分濃度空間探索2018

    • 著者名/発表者名
      松浦友亮
    • 学会等名
      2018年度日本農芸化学会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] リポソームディスプレイ法を用いた膜タンパク質の創生と解析2017

    • 著者名/発表者名
      松浦友亮
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会(ConBio2017)
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Decorating liposome surface with biological molecule and its application2017

    • 著者名/発表者名
      Tomoaki Matsuura
    • 学会等名
      IGER International Symposium on Cell Surface Structures and Functions 2017
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] In vitro membrane protein engineering by liposome display2017

    • 著者名/発表者名
      Tomoaki Matsuura
    • 学会等名
      The 17th KIAS Conference on Protein Structure and Function
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] リポソーム内で膜タンパク質を合成するシステムの構築と応用2016

    • 著者名/発表者名
      松浦友亮
    • 学会等名
      第29回植物脂質シンポジウム
    • 発表場所
      大阪大学会館(大阪府・豊中市)
    • 年月日
      2016-11-25
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] セルフリータンパク質合成系を用いた進化分子工学技術の開発2016

    • 著者名/発表者名
      松浦友亮
    • 学会等名
      第52回生物工学奨励賞(斎藤賞) 受賞講演
    • 発表場所
      富山国際会議場など(富山県・富山市)
    • 年月日
      2016-09-28
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 招待講演

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公開日: 2016-04-26   更新日: 2022-02-28  

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