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生命分子機能を、時空間を制御して解明する設計分子プローブ

公募研究

研究領域生命分子システムにおける動的秩序形成と高次機能発現
研究課題/領域番号 16H00768
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 理工系
研究機関大阪大学

研究代表者

菊地 和也  大阪大学, 工学研究科, 教授 (70292951)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2018-03-31
研究課題ステータス 中途終了 (2017年度)
配分額 *注記
5,720千円 (直接経費: 4,400千円、間接経費: 1,320千円)
2017年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2016年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
キーワード化学プローブ / 生細胞イメージング / DNAメチル化 / 蛋白質ラベル化 / 1分子イメージング / タンパク質ラベル化 / 1分子イメージング
研究実績の概要

本年度ではエピジェネティックな遺伝子発現制御に関与するDNAメチル化動態をイメージングする手法の開発を行った。メチル化DNA結合タンパク質であるMBDに着目し、当研究室でこれまでに開発したPYPタグによる蛋白質ラベル化手法を用いて、メチル化DNAに結合したときのみ蛍光を発するイメージング法を考案した。このイメージング法においては、MBD融合蛍光タンパク質を使う方法と比べて、メチル化DNAに結合しないタンパク質由来のバックグラウンドシグナルを低下させることが期待できる。そのため、新たなタンパク質ラベル化蛍光プローブとして、PYPタグに結合するリガンドと、DNAに結合した時に蛍光が上昇するDNA結合色素、オキサゾールイエローを組み合わせた化合物を設計、合成した。合成した蛍光プローブはMBPと融合発現させたPYPタグと速やかに反応し複合体を形成した。また、ゲルシフトアッセイの結果より、MBP-PYPはメチル化DNAに対して特異的に結合していることを確認した。さらに、蛍光スペクトル測定により、メチル化DNA存在下でMBD-PYPにラベル化した蛍光プローブ由来の蛍光強度が上昇することが分かった。これらの結果により、本蛍光プローブがメチル化DNAを特異的に蛍光検出可能であることが示された。培養細胞にMBD-PYPを発現し、開発した蛍光プローブを添加したところ、核内の一部から蛍光シグナルが観測された。この蛍光シグナルは、メチル化DNA阻害剤である5-アザシチジンで処理することで濃度依存的に減少した。したがって、本手法により、細胞内のDNAメチル化の動態をイメージングできることが示された。本イメージング法は新たなエピジェネティクス解析ツールとなることが期待できる。

現在までの達成度 (段落)

29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

29年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2017 実績報告書
  • 2016 実績報告書
  • 研究成果

    (8件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 1件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 3件、 招待講演 3件)

  • [雑誌論文] Enzyme-Triggered Compound Release using Functionalized Antimicrobial Peptide Derivatives2017

    • 著者名/発表者名
      Shin Mizukami, Masayoshi Kashibe, Kengo Matsumoto, Yuichiro Hori, Kazuya Kikuchi
    • 雑誌名

      Chem. Sci.

      巻: 8 号: 4 ページ: 3047-3053

    • DOI

      10.1039/c6sc04435b

    • 関連する報告書
      2017 実績報告書 2016 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Photostable and Photoswitching Fluorescent Dyes for Super-resolution Imaging2017

    • 著者名/発表者名
      M. Minoshima, K. Kikuchi
    • 雑誌名

      Journal of Biological Inorganic Chemistry

      巻: - 号: 5 ページ: 1-14

    • DOI

      10.1007/s00775-016-1435-y

    • 関連する報告書
      2017 実績報告書 2016 実績報告書
    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Fluorogenic Probes Reveal a Role of GLUT4 N-glycosylation in Intracellular Trafficking2016

    • 著者名/発表者名
      S. Hirayama, Y. Hori, Z. Benedek, T. Suzuki, K. Kikuchi
    • 雑誌名

      Nature Chemical Biology

      巻: 12 号: 10 ページ: 853-859

    • DOI

      10.1038/nchembio.2156

    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Real-Time Intravital Imaging of pH Variation Associated with Osteoclast Activity2016

    • 著者名/発表者名
      Hiroki Maeda, Toshiyuki Kowada, Junichi Kikuta, Masayuki Furuya, Mai Shirazaki, Shin Mizukami, Masaru Ishii, Kazuya Kikuchi
    • 雑誌名

      Nat. Chem. Biol.

      巻: 12 号: 8 ページ: 579-585

    • DOI

      10.1038/nchembio.2096

    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Fabrication of ‘Clickable’ Polyfluorene Nanowires with High Aspect Ratio as Biological Sensing Platforms2016

    • 著者名/発表者名
      T. Wasin, K. Enomoto, T. Sakurai, V. Padalkar, H. Cheng, M. Tang, A. Horio, D., Sakamaki, M. Omichi, A. Saeki, K. Kikuchi, Y. Hori, A. Chiba, Y. Saito, T. Kamiya, M. Sugimoto, S. Seki
    • 雑誌名

      ACS Sensors

      巻: 6 号: 6 ページ: 766-774

    • DOI

      10.1021/acssensors.6b00070

    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 査読あり / 国際共著
  • [学会発表] Real-time Intravital Imaging of pH Variation Associated with Osteoclast Activity Using BODIPY Based Two Photon Excitation Probes2016

    • 著者名/発表者名
      K. Kikuchi
    • 学会等名
      The 8th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference (AsBIC VIII)
    • 発表場所
      Auckland, New Zealand
    • 年月日
      2016-12-05
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Real-time Intravital Imaging of pH Variation Associated with Osteoclast Activity2016

    • 著者名/発表者名
      K. Kikuchi
    • 学会等名
      MSMLG 2016, 5th International Conference on Molecular Sensors and Molecular Logic Gates
    • 発表場所
      Bath, UK
    • 年月日
      2016-07-24
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Real-time Intravital Imaging of pH Variation Associated with Osteoclast Activity Using BODIPY Based Two Photon Excitation Probes2016

    • 著者名/発表者名
      K. Kikuchi
    • 学会等名
      ICPP-9, 9th International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines
    • 発表場所
      Nanjing, China
    • 年月日
      2016-07-03
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演

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公開日: 2016-04-26   更新日: 2018-12-17  

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