RNAアプタマー・スイッチング素子・蛋白質のスライディングの動作原理の解明と活用

• 研究領域: 理論と実験の協奏による柔らかな分子系の機能の科学
• 研究課題/領域番号: 16H00833
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 理工系
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 片平 正人 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (70211844)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2017年度)
• 配分額: 6,760千円 (直接経費: 5,200千円、間接経費: 1,560千円); 2017年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円); 2016年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
• キーワード: リアルタイムＮＭＲ / ＡＰＯＢＥＣ蛋白質 / TLS蛋白質 / in-cell NMR / デアミネーション / ＤＮＡ / アプタマー / スライディング / ＡＰＯＢＥＣ3蛋白質 / 構造解析 / ＮＭＲ / ４重鎖 / プリオン / Ｔａｔ / RNAアプタマー / スイッチング素子 / 立体構造 / NMR

研究実績の概要

APOBEC3(A3)タンパク質群に属するA3B、A3F及びA3Gによる脱アミノ化反応を、リアルタイムNMR法によって解析した。A3Gは長鎖のDNA中の標的配列に対する活性が高いが、A3Bは短鎖のDNA中の標的配列に対する活性が高い事が分かった。またA3GはDNA鎖中の5'端近くに位置する標的配列に対する活性が高いが、A3BはDNA鎖中の中央に位置する標的配列に対する活性が高い事も分かった。A3Gは、DNA上の標的配列以外の箇所に非特異的に結合後、DNA上をスライディングする事で、標的配列を効率的に見つけて脱アミノ化反応を生じる。しかしA3BはDNAへの低い結合能の為に、スライディングの最中に標的核酸を見つける前に、DNA鎖から解離してしまう。この違いによって、両タンパク質における鎖長依存性及び位置依存性の違いを合理的に説明できた。
細胞中における分子混雑下では、生体分子の構造と相互作用が、試験管内とは異なる可能性が指摘されている。この問いに答える為に、ヒト細胞中におけるタンパク質のNMRシグナルを観測し、研究が進められている。一方核酸に関しては、細胞への導入が困難であった。今回毒素タンパク質SLOを用いた物質の導入法を高度化する事でこの問題を克服し、ヒト細胞中における核酸のNMRシグナルを観測する事に初めて成功した。
DNAの光損傷に伴いサイクリンD1遺伝子の上流領域から転写された非コードRNAは、同遺伝子のプロモータに繋留され、TLS蛋白質をリクルートする。結合に伴いTLSは構造変化し、CBP/p300と相互作用してこれらのHAT活性を阻害し、転写を阻害すると想定されている。今回TLSと非コードRNAの局所的な相互作用をNMR法で明らかにすると共に、この相互作用よってTLS分子全体に引き起こされる大きな構造変化を、FRETとAFMによって捉える事に成功した。

現在までの達成度 (段落)

29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

29年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Influence of the DNA sequence/length and pH on deaminase activity, as well as the roles of the amino acid residues around the catalytic center of APOBEC3F (2018)
  • 著者名/発表者名: Wan Li、Nagata Takashi、Katahira Masato
  • 雑誌名: Phys Chem Chem Phys 巻: 20 号: 5 ページ: 3109-3117
  • DOI: 10.1039/c7cp04477a
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The first successful observation of in-cell NMR signals of DNA and RNA in living human cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamaoki Yudai、Kiyoishi Ayaka、Miyake Masayuki、Kano Fumi、Murata Masayuki、Nagata Takashi、Katahira Masato
  • 雑誌名: Phys Chem Chem Phys 巻: 20 号: 5 ページ: 2982-2985
  • DOI: 10.1039/c7cp05188c
  • NAID: 130007557810
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The C-terminal cytidine deaminase domain of APOBEC3G itself undergoes intersegmental transfer for a target search, as revealed by real-time NMR monitoring (2018)
  • 著者名/発表者名: Kamba Keisuke、Nagata Takashi、Katahira Masato
  • 雑誌名: Phys Chem Chem Phys 巻: 20 号: 5 ページ: 2976-2981
  • DOI: 10.1039/c7cp05171a
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Observation by Real-Time NMR and Interpretation of Length- and Location-Dependent Deamination Activity of APOBEC3B (2017)
  • 著者名/発表者名: Wan Li、Nagata Takashi、Morishita Ryo、Takaori-Kondo Akifumi、Katahira Masato
  • 雑誌名: ACS Chem Biol 巻: 12 号: 11 ページ: 2704-2708
  • DOI: 10.1021/acschembio.7b00662
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The binding specificity of translocated in liposarcoma/fused in sarcoma with lncRNA transcribed from the promoter region of cyclin D1 (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoneda, R., Suzuki, S., Mashima, T., Kondo, K., Nagata, T., Katahira, M. and Kurokawa, R.
  • 雑誌名: Cell Biosci. 巻: 6(4) 号: 1 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1186/s13578-016-0068-8
  • NAID: 120005763383
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Characterization of the deamination coupled with sliding along DNA of anti-HIV factor APOBEC3G on the basis of the pH-dependence of deamination revealed by real-time NMR monitoring (2016)
  • 著者名/発表者名: Kamba K, Nagata T, Katahira M
  • 雑誌名: Front. Microbiol. 巻: 0 ページ: 0-0
  • DOI: 10.3389/fmicb.2016.00587
  • NAID: 120005947002
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] Interactions between non-coding RNA and TLS/FUS, and distinct difference in enzymatic behavior among APOBEC3 proteins as revealed by real-time NMR monitoring (2017)
  • 著者名/発表者名: Katahira, M.
  • 学会等名: The 7th Asia-Pacific NMR Symposium
  • 発表場所: Bangalore(インド)
  • 年月日: 2017-02-16
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Sliding and intersegmental transfer along DNA enhance the enzymatic activity of APOBEC3G as revealed by real-time NMR monitoring methods (2017)
  • 著者名/発表者名: Kamba, K., Nagata, T. and Katahira, M.
  • 学会等名: The 7th Asia-Pacific NMR Symposium
  • 発表場所: Bangalore（インド）
  • 年月日: 2017-02-16
  • 国際学会
• [学会発表] APOBEC3Gのストランド間移動の実時間NMR検出 (2017)
  • 著者名/発表者名: 神庭圭佑，永田崇，片平正人
  • 学会等名: 第17回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] TLS/FUS のRNA認識機構と結合に伴うコンフォメーション変化の研究 (2017)
  • 著者名/発表者名: 真嶋司，小澤 駿介，N. Hamad，米田竜馬，黒川理樹，永田崇，片平正人
  • 学会等名: 第17回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] Conformational change detection of translocated in liposarcoma，TLS，upon binding to various RNAs (2017)
  • 著者名/発表者名: N. Hamad, T. Mashima, Y. Yamaoki, K. Kondo, R. Ku-rokawa, T. Nagata, M. Katahira
  • 学会等名: 第19回日本RNA学会年会
• [学会発表] 基質DNAの長さ、濃度、及び標的配列位置がAPOBEC3Fの脱アミノ活性に及ぼす影響 (2017)
  • 著者名/発表者名: 万里，永田崇，片平正人
  • 学会等名: 第55回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Structural Change of Protein Caused by Non-Coding RNA，and Distinct Difference in Enzymatic Behavior among APOBEC3 Proteins as Revealed by Real-time NMR Method (2017)
  • 著者名/発表者名: M. Katahira
  • 学会等名: Taiwan-Japan Biomedical Symposium on Magnetic Resonance
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Characterization of the cytidine deamination properties of human APOBEC3B by real-time NMR，which are quite different from those of APOBEC3G (2017)
  • 著者名/発表者名: L. Wan, T. Nagata, R. Morishita, A. Takaori-Kondo, M. Katahira
  • 学会等名: 44th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 国際学会
• [学会発表] Interaction between non-coding RNA and TLS/FUS protein，and structural change (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Mashima, T. Nagata, N. Hamad, S. Ozawa, Y. Yamaoki, K. Kondo, H. Watanabe, R. Yoneda, T. Uchi-hashi, R. Kurokawa, M. Katahira
  • 学会等名: The 44th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 国際学会
• [学会発表] 非コードRNAとTLS/FUSタンパク質の相互作用様式と結合に伴うTLS/FUSの大きな構造変化 (2017)
  • 著者名/発表者名: 真嶋司，ハマッド ネスリン，小澤駿介，渡辺大輝，内橋貴之，米田竜馬，黒川理樹，永田崇，片平正人
  • 学会等名: 第56回NMR討論会
• [学会発表] TLS/FUS タンパク質と非コードRNAの認識機構の解明と結合に伴うTLS/FUS の大きな構造変化の検出 (2017)
  • 著者名/発表者名: 片平正人
  • 学会等名: 生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] Invention of K+-responsive Tat-binding RNA aptamer and hammerhead ribozyme, and in-cell NMR of nucleic acids (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamaoki, Y., Mashima, T., Nagata, T. and Katahira, M.
  • 学会等名: The 43rd International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • 発表場所: 熊本大学（熊本）
  • 年月日: 2016-09-27
  • 国際学会
• [学会発表] K+-responsive activation of ribozyme system via structural transition from duplex to dual-quadruplex requiting no heating and cooling treatment (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamaoki, Y., Mashima, T., Nagata, T. and Katahira, M.
  • 学会等名: The XXVIIth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • 発表場所: 京都国際会議場（京都）
  • 年月日: 2016-08-21
  • 国際学会
• [学会発表] The 21st Annual Meeting of the RNA Society (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamaoki, Y., Mashima, T., Nagata, T. and Katahira, M.
  • 学会等名: K+-responsive activation of dual-quadruplex forming ribozyme system requiring no heating and cooling treatment
  • 発表場所: 京都国際会議場（京都）
  • 年月日: 2016-06-28
  • 国際学会
• [備考] 片平研究室
  • URL: http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/bio/