液滴衝突法による微量タンパク質の反応追跡

• 研究領域: 理論と実験の協奏による柔らかな分子系の機能の科学
• 研究課題/領域番号: 16H00848
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 理工系
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 小倉 尚志 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (70183770)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2017年度)
• 配分額: 6,760千円 (直接経費: 5,200千円、間接経費: 1,560千円); 2017年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円); 2016年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
• キーワード: 酵素反応 / 高速混合器 / 微小液滴 / インクジェット / 分光測定 / 反応ダイナミクス / 機能メカニズム / 酵素 / インクジェットヘッド / 振動分光 / 液滴 / タンパク質 / 酵素反応機構 / ES複合体 / 吸収分光

研究実績の概要

いかなる生命現象も突き詰めるとタンパク質が駆動する化学反応がもとになっている。したがって、生命とは何か？という問いに答えるためには、タンパク質の機能メカニズムを明らかにする必要がある。この目的のためにはタンパク質の立体構造とダイナミクスの情報が不可欠である。本研究の目的は、タンパク質の構造ダイナミクスを研究するための微量高速混合装置の試作である。構想では、2つのインクジェットヘッドから高速（1～10 m/s）で吐出される微量（100 pL～1 nL）の酵素および基質をそれぞれ含む液滴を衝突させることによって混合し、酵素反応を開始させて分光法により時間軸に沿って追跡する。
2台のインクジェットヘッドをそれぞれxyzθ軸微動ステージに固定したミキサーを製作した。そして、2つの液滴の衝突・混合を行った。一方、微量試料（80 μl）用吸い上げ式ヘッドについては、電圧パルス印加前に試料溶液が流れ出さないよう保持するために±5 kPa程度の安定した微圧を発生する必要があり、そのための微圧発生装置を組立てた。それを用いて吸い上げ式ヘッドによる液滴の吐出に成功した。ここまでを平成２７年度までに行った。
平成２８年度にはフェノールレッドの蛍光強度がpHにより変化する性質を用いて混合の時定数を求めた。すなわち、フェノールレッドのアルカリ性溶液と酸性緩衝液を衝突させ、最終pHを酸性にすることにより、蛍光光度が低下する性質を利用した。この測定結果より、液滴速度3.8 m/sのとき、混合の時定数は300マイクロ秒と決定した。この装置によりペルオキシダーゼ（西洋わさび由来）と過酸化水素を混合してCompound Iを生成する系を測定中である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

２台のインクジェットヘッドから吐出される２つの液滴を衝突させて混合するミキサーを組み立てた。その混合時定数を測定したところ、300マイクロ秒であった。この装置を酵素タンパク質であるペルオキシダーゼに応用する実験に取りかかった。

今後の研究の推進方策

ペルオキシダーゼの系により、酵素タンパク質への応用の可能性を確かめる。次にシトクロムc酸化酵素に応用し、嫌気性を保った測定系に発展させる。また、合成タンパク質など微量しか得られない試料に対して応用していく。

研究成果

• [国際共同研究] Ewha Woman's University/Daegu Gyeongbuk Inst. Sci. & Tech.(韓国)
• [国際共同研究] Stanford University/University of Louisville(米国)
• [雑誌論文] Improved Stopped-Flow Time-Resolved Resonance Raman Spectroscopy Device for Studying Enzymatic Reactions (2017)
  • 著者名/発表者名: S. Yanagisawa, M. S. Deshpande, S. Hirota, T. Nakagawa, and T. Ogura
  • 雑誌名: Journal of Raman Spectroscopy 巻: 48 号: 5 ページ: 680-685
  • DOI: 10.1002/jrs.5100
  • NAID: 120006334945
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A Model for the Active-Site Formation Process in DMSO Reductase Family Molybdenum Enzymes Involving Oxido－Alcoholato and Oxido－Thiolato Molybdenum(VI) Core Structures (2016)
  • 著者名/発表者名: Hideki Sugimoto, Masanori Sato, Kaori Asano, Takeyuki Suzuki, Kaoru Mieda, Takashi Ogura, Takashi Matsumoto, Logan J. Giles, Amrit Pokhrel, Martin L. Kirk, and Shinobu Itoh
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 55 号: 4 ページ: 1542-1550
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.5b02395
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Purification of Active Respiratory Supercomplex from Bovine Heart Mitochondria Enables Functional Studies (2016)
  • 著者名/発表者名: Kyoko Shinzawa-Itoh, Harunobu Shimomura, Sachiko Yanagisawa, Satoru Shimada, Ryoko Takahashi, Marika Oosaki, Takashi Ogura, and Tomitake Tsukihara
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 巻: 291 号: 8 ページ: 4187-4184
  • DOI: 10.1074/jbc.m115.680553
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Reactivity of a Cobalt(III)-Hydroperoxo Complex in Electrophilic Reactions. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shin, B., Sutherlin, K. D., Ohta, T., Ogura, T., Solomon, E. I., & Cho, J.
  • 雑誌名: Inorganic Chemistry 巻: 55 号: 23 ページ: 12391-12399
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.6b02288
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A Ruthenium(III)-Oxyl Complex Bearing Strong Radical Character (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Shimoyama, T. Ishizuka, H. Kotani, Y. Shiota, K. Yoshizawa, K. Mieda, T. Ogura, T. Okajima, S. Nozawa, T. Kojima
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: 55 号: 45 ページ: 14041-14045
  • DOI: 10.1002/anie.201607861
  • 査読あり
• [雑誌論文] New Mechanistic Insight into Intramolecular Arene Hydroxylation Initiated by (m-1,2-Peroxo)diiron(III) Complexes with Dinucleating Ligands (2016)
  • 著者名/発表者名: M. Sekino, H. Furutachi et. al.
  • 雑誌名: Danton Trans. 巻: 45 号: 2 ページ: 469-473
  • DOI: 10.1039/c5dt04088d
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A Nearly On-axis Spectroscopic System for Simultaneously Measuring UV-visible Absorption and X-ray Diffraction in the SPring-8 Structural Genomics Beamline (2016)
  • 著者名/発表者名: M. Sakaguchi, T. Kimura, T. Nishida, T. Tosha, Y. Yamaguchi, S. Yanagisawa, G. Ueno, H. Murakami, H. Ago, M. Yamamoto, T. Ogura, Y. Shiro, M. Kubo
  • 雑誌名: J. Synchro. Rad. 巻: 23 号: 1 ページ: 334-338
  • DOI: 10.1107/s1600577515018275
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The secondary coordination sphere and axial ligand effects on oxygen reduction reaction by iron porphyrins: a DFT computational study. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ohta, T., Nagaraju, P., Liu, J. G., Ogura, T., & Naruta, Y.
  • 雑誌名: Journal of Biological Inorganic Chemistry 巻: 21 号: 5-6 ページ: 745-755
  • DOI: 10.1007/s00775-016-1380-9
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The secondary coordination sphere controlled reactivity of a ferric-superoxo heme: unexpected conversion to a ferric hydroperoxo intermediate by reaction with a high-spin ferrous heme. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagaraju, P., Ohta, T., Liu, J. G., Ogura, T., & Naruta, Y.
  • 雑誌名: Chem. Commun. (Camb.) 巻: 52 号: 45 ページ: 7213-7216
  • DOI: 10.1039/c6cc02162j
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Heme Orientation of Cavity Mutant Hemoglobins (His F8 --> Gly) in Either alpha or beta Subunits: Circular Dichroism, (1) H NMR, and Resonance Raman Studies (2016)
  • 著者名/発表者名: Nagai, M., Nagai, Y., Aki, Y., Sakurai, H., Mizusawa, N., Ogura, T., Kitagawa, T., Yamamoto, Y. and Nagatomo, S.
  • 雑誌名: Chirality 巻: 28 ページ: 585-592
  • 査読あり
• [雑誌論文] Formation and High Reactivity of the anti-Dioxo Form of High- Spin m-Oxodioxodiiron(IV) as the Active Species That Cleaves Strong C (2016)
  • 著者名/発表者名: Masahito Kodera,* Shin Ishiga, Tomokazu Tsuji, Katsutoshi Sakurai, Yutaka Hitomi, Yoshihito Shiota, P. K. Sajith, Kazunari Yoshizawa, Kaoru Mieda, and Takashi Ogura
  • 雑誌名: Chemistry A European Journal 巻: 17 号: 17 ページ: 1-14
  • DOI: 10.1002/chem.201600048
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Effects of Heme Electronic Structure and Distal Polar Interaction on Functional and Vibrational Properties of Myoglobin (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Kanai, R. Nishimura, K. Nishiyama, T. Shibata, S. Yanagisawa, T. Ogura, T. Matsuo, S. Hirota, S. Neya, A. Suzuki, Y. Yamamoto
  • 雑誌名: Inorg. Chem. 巻: 55 号: 4 ページ: 1613-1622
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.5b02520
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Manganese(V)-Oxo Complex: Synthesis by Dioxygen Activation and Enhancement of Its Oxidizing Power by Binding Scandium Ion. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hong, S., Lee, Y. M., Sankaralingam, M., Vardhaman, A. K., Park, Y. J., Cho, K. Ogura, T., Sarangi, R., Fukuzumi, S. and Nam, W.
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Soc. 巻: 138 号: 27 ページ: 8523-8532
  • DOI: 10.1021/jacs.6b03874
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The functional role of the structure of the dioxo-isobacteriochlorin in the catalytic site of cytochrome cd1 for the reduction of nitrite (2016)
  • 著者名/発表者名: H. Fujii, D. Yamaki, T. Ogura, M. Hada
  • 雑誌名: Chem. Sci. 巻: 7 号: 4 ページ: 2896-2906
  • DOI: 10.1039/c5sc04825g
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] チトクロムc酸化酵素の水素結合状態変化の酸素還元反応への影響 (2016)
  • 著者名/発表者名: 青柳裕大, 西口達人, 新澤-伊藤 恭子, 吉川信也, 中島 聡, 小倉尚志
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25
• [学会発表] 時間分解共鳴ラマン分光法によるチトクローム酸化酵素の共役機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中島 聡, 中川善之, 伊藤-新澤 恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25
• [学会発表] Elucidating the mechanisms of proton pumping in cytochrome c oxidase by time resolved IR spectroscopy (2016)
  • 著者名/発表者名: Chen Li, Tatsuhito Nishiguchi, Shun Yamauchi, Kyoko Shinzawa-Itoh, Shinya Yoshikawa, Satoru Nakashima, Takashi Ogura
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25
• [学会発表] 共鳴ラマン分光法による2価コバラミンの軸配位子に依存した構造変化の検出 (2016)
  • 著者名/発表者名: 三枝 馨, Abdullah Al Mamun, Pawel M. Kozlowski, 小倉尚志
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25
• [学会発表] 四量体ヒトヘモグロビンにおける2つのα鎖に特有のFe-His結合と四次構造との関連 (2016)
  • 著者名/発表者名: 長友重紀, 齋藤一弥, 長井雅子, 小倉尚志, 北川禎三
  • 学会等名: 第54回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: つくば国際会議場（つくば市）
  • 年月日: 2016-11-25
• [学会発表] 液滴衝突法による微量タンパク質の反応追跡 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小倉尚志, 渡部明莉, 西畑佳晃, 程上紗央里, 渡邉祥子, 柳澤幸子, 中島 聡
  • 学会等名: 新学術領域「柔らかな分子系」第4回公開シンポジウム
  • 発表場所: 名古屋工業大学（名古屋市）
  • 年月日: 2016-10-27
• [学会発表] Catalytic Substrate Oxidation by Ruthenium(II)-Aqua Complexes Bearing N-Heterocyclic Carbene Ligands (2016)
  • 著者名/発表者名: Shimoyama, Y., Ishizuka, T., Kotani, H., Mieda, K., Ogura, T., Shiota, Y., Kojima, T.
  • 学会等名: 錯体化学会第66回討論会
  • 発表場所: 福岡大学（福岡市）
  • 年月日: 2016-09-10
• [学会発表] A new method of assaying the hydrogenase activity by means of Raman spectroscopy (2016)
  • 著者名/発表者名: K. Nishikawa, S. Inomata, Y. Kawahara, K. Fukutani, T. Yagi, T. Ogura, & Y. Higuchi
  • 学会等名: 11th International Hydrogenase Conference
  • 発表場所: Marseille (France)
  • 年月日: 2016-07-10
  • 国際学会
• [学会発表] 時間分解振動分光法によるチトクロームc酸化酵素のプロトンポンプ共役機構の研究 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中島 聡, 中川善之, Li Chen, 新澤-伊藤 恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 第43回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 名古屋大学（名古屋市）
  • 年月日: 2016-06-24
• [学会発表] キャビティ内に形成した三核銅中心の性質とマルチ銅酸化酵素との関連 (2016)
  • 著者名/発表者名: 永田光知郎, 畑中 翼, 岩崎友哉, 小澤智宏, 猪股智彦, 小倉尚志, 舩橋靖博
  • 学会等名: 第26回金属の関与する生体関連反応シンポジウム（SRM2016）
  • 発表場所: 北海道大学（札幌市）
  • 年月日: 2016-06-17
• [学会発表] チトクローム酸化酵素の反応サイトの時間分解ラマン分光法による動的構造解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 中島 聡, 中川善之, 伊藤-新澤 恭子, 吉川信也, 小倉尚志
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07
• [学会発表] X線自由電子レーザーを用いた、ポンプ・プローブ法によるチトクロム酸化酵素の時分割結晶構造解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 波多野啓太, 島田敦広, 宮本朱梨, 馬場清喜, 山下 恵太郎, 久保 稔, 吾郷日出夫, 平田邦夫, 上野 剛, 村上宏典, 山本雅貴, 熊坂 崇, 山下栄樹, 小倉尚志, 月原冨武, 吉川信也
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07
• [学会発表] 酵素に結合した感応性化学種の振動分光法による選択的検出と反応機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小倉尚志, 渡邉祥子, 柳澤幸子, 中島 聡
  • 学会等名: 新学術領域「感応性化学種」第６回公開シンポジウム
  • 発表場所: 広島大学東広島キャンパス（東広島市鏡山）
  • 年月日: 2016-05-20
• [図書] フロンティア生物無機化学（第４章呼吸系を分担） (2016)
  • 著者名/発表者名: 小倉尚志（伊東 忍・青野重利・林 高史編著）
  • 総ページ数: 23
  • 出版者: 三共出版
• [備考] 兵庫県立大学 生命理学研究科 ピコバイオロジー専攻 生体物質構造学II分野
  • URL: http://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/biophys2/index-j.html