“無蛍光”蛍光タンパク質で実現する組織深部分子活性化イメージング

• 研究領域: 共鳴誘導で革新するバイオイメージング
• 研究課題/領域番号: 16H01437
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 生理学研究所
• 研究代表者: 村越 秀治 生理学研究所, 脳機能計測・支援センター, 准教授 (90608142)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2017年度)
• 配分額: 11,050千円 (直接経費: 8,500千円、間接経費: 2,550千円); 2017年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円); 2016年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)
• キーワード: 蛍光タンパク質 / FRET

研究実績の概要

今年度は、赤色蛍光タンパク質であるmCherryと色素タンパク質であるUltramarineのキメラを作製し、これを鋳型にして、Error-prone PCRによるランダム変異導入により、吸収はあるが量子収率がほぼ0の無蛍光赤色蛍光タンパク質（ShadowR）の開発を進めて来た。作製したキメラ分子は凝集しやすく、また大腸菌内でも封入体に入り易かったため、まずは、キメラ分子の親水性を高くすることでダイマー化や凝集が起こりにくくなるようにすることを目指した。具体的には、キメラ分子のアミノ酸の内、側鎖が外側を向いているアミノ酸をターゲットにして飽和変異導入を行った。変異体の内、吸収の大きいものを大腸菌ライブラリーよりピックアップし、これらのシークエンスを調べた。シークエンスを行った変異体の内、アミノ酸が元のよりもより親水性のアミノ酸に置換されているものをピックアップした。このような操作を数十か所のアミノ酸について行うことにより親水性の高い変異体（ShadowR）を作製することに成功した。

現在までの達成度 (段落)

29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

29年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] 光応答性CaMKII阻害ペプチドの開発とシナプス可塑性研究への応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 村越秀治
  • 雑誌名: CLINICAL CALCIUM 巻: 28 ページ: 414-419
• [雑誌論文] Kinetics of Endogenous CaMKII Required for Synaptic Plasticity Revealed by Optogenetic Kinase Inhibitor (2017)
  • 著者名/発表者名: Hideji Murakoshi, Myung Eun Shin, Paula Parra-Bueno, Erzsebet M. Szatmari, Akihiro C.E. Shibata, Ryohei Yasuda
  • 雑誌名: Neuron 巻: 94 号: 1 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2017.02.036
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] ShadowY: a dark yellow fluorescent protein for FLIM-based FRET measurement (2017)
  • 著者名/発表者名: Murakoshi Hideji、Shibata Akihiro C. E.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 号: 1 ページ: 1-10
  • DOI: 10.1038/s41598-017-07002-4
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Imaging signal transduction in dendrites using genetically-encoded fluorescent proteins. (2016)
  • 著者名/発表者名: Murakoshi H and Yasuda R.
  • 雑誌名: Dendritets: development and disease. 巻: - ページ: 139-154
  • 国際共著
• [雑誌論文] Dual observation of the ATP-evoked small GTPase activation and Ca2+ transient in astrocytes using a dark red fluorescent protein (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakahata Y, Nabekura J, Murakoshi H
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 22 号: 1 ページ: 39564-39564
  • DOI: 10.1038/srep39564
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 光らない蛍光タンパク質で細胞内分子活性を見る (2017)
  • 著者名/発表者名: 村越秀治
  • 学会等名: 第2回ルミノジェネティクス研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 2光子蛍光寿命イメージングによる細胞内シグナル伝達解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 村越秀治
  • 学会等名: 第39回神経組織培養研究会
  • 招待講演
• [学会発表] Optogenetic manipulation and imaging of CaMKII-Rho signaling pathway during synaptic plasticity. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hideji Murakoshi
  • 学会等名: 2017 Yonsei Univ-Korea Univ-NIPS symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Spatiotemporal manipulation and imaging of signaling molecules in dendritic spines (2016)
  • 著者名/発表者名: Hideji Murakoshi
  • 学会等名: The 47th NIPS International Symposium
  • 発表場所: 愛知県 岡崎市 岡崎カンファレンスセンター
  • 年月日: 2016-10-26
  • 国際学会 / 招待講演
• [備考] 村越研究室/生理学研究所/MurakoshiLab
  • URL: http://www.nips.ac.jp/multiphoton/