抗腫瘍性マクロライド抗生物質生合成マシナリーのリデザイン

• 研究領域: 生物合成系の再設計による複雑骨格機能分子の革新的創成科学
• 研究課題/領域番号: 17H05434
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 理工系
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 工藤 史貴 東京工業大学, 理学院, 准教授 (00361783)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2019-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2018年度)
• 配分額: 7,540千円 (直接経費: 5,800千円、間接経費: 1,740千円); 2018年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円); 2017年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
• キーワード: マクロライド抗生物質 / ポリケチド合成酵素 / 酵素エンジニアリング / 生合成 / タンパク質間相互作用 / 酵素構造解析 / アシル基転移酵素 / タンパク質構造解析 / 遺伝子組換え / マクロライド系抗生物質 / ケミカルバイオロジー / 分子プローブ / 酵素工学 / 遺伝子工学

研究実績の概要

本研究では、抗腫瘍性マクロライド抗生物質FD-891のポリケチド合成酵素（PKS）の触媒ドメイン間の相互作用機構を解明し、その知見を生かしたPKS遺伝子改変によりスターター部位の異なる類縁体を生合成することを目指した。
本研究期間では、スターター部位の生合成に関わるローディングPKSのアシルキャリアープロテイン（ACP）ドメインとアシル基転移酵素(AT)ドメイン、ACPドメインとβ-ケトアシルACP合成酵素（KS）ドメインの相互作用機構を解明するために、分子プローブを用いてクロスリンク反応させた複合体を精製して結晶化を検討した。また、ACPドメインを単独発現させて、単独発現させたATドメインとKSドメインとのクロスリンク反応による複合体化と結晶化を検討した。いずれの条件においても結晶構造解析に供することのできる結晶は得られていないが、クロスリンク反応の効率が複合体サンプルの純度に大きな影響を与えることがわかった。
遺伝子改変による類縁体創製に関しては、FD-891のローディングPKSのATドメインを、前年度に生合成遺伝子クラスターを決定したビルストマイシン生合成に関わるPKSの基質特異性の異なるATドメインと入れ換えた。相同性のある酵素構造情報を基に境目を決定して入れ換えた結果、一炭素増炭した類縁体と二炭素増炭した類縁体を生合成させることに成功した。一方、メトキシ基を導入した類縁体の生合成も検討したが、期待した化合物を得ることができなかった。入れ換えたATドメインがACPドメインと相互作用できない可能性、KSドメインがメトキシ基を導入した中間体を認識できなかった可能性などが考えられる。今後はうまくできなかった原因を明らかにして、それを解消すべき遺伝子改変を行い新たな類縁体を生合成する予定である。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] An Engineered Aryl Acid Adenylation Domain with an Enlarged Substrate Binding Pocket (2019)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa, F., Miyanaga, A., Kitayama, H., Nakamura, S., Nakanishi, I., Kudo, F., Eguchi, T., Tanabe, G.
  • 雑誌名: Angew. Chem. Int. Ed. 巻: 58 号: 21 ページ: 6906-6910
  • DOI: 10.1002/anie.201900318
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis of the nonribosomal codes for nonproteinogenic amino acid selective adenylation enzymes in the biosynthesis of natural products (2019)
  • 著者名/発表者名: Kudo Fumitaka、Miyanaga Akimasa、Eguchi Tadashi
  • 雑誌名: Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 巻: 46 号: 3-4 ページ: 515-536
  • DOI: 10.1007/s10295-018-2084-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional and structural characterization of IdnL7, an adenylation enzyme involved in incednine biosynthesis (2019)
  • 著者名/発表者名: Cieslak, J., Miyanaga, A., Takaishi, M., Kudo, F., Eguchi, T.
  • 雑誌名: Acta Crystallogr. F Struct. Biol. Commun. 巻: 75 号: 4 ページ: 299-306
  • DOI: 10.1107/s2053230x19002863
  • 査読あり
• [雑誌論文] Total Synthesis of Actinorhodin (2019)
  • 著者名/発表者名: Ninomiya, M., Ando, Y., Kudo, F., Ohmori, K., Suzuki, K.
  • 雑誌名: Angew. Chem. Int. Ed. 巻: 58 号: 13 ページ: 4264-4270
  • DOI: 10.1002/anie.201814172
  • 査読あり
• [雑誌論文] C-Methylation Catalyzed by Fom3, a Cobalamin-Dependent Radical S-adenosyl-l-methionine Enzyme in Fosfomycin Biosynthesis, Proceeds with Inversion of Configuration (2018)
  • 著者名/発表者名: Sato, S., Kudo, F., Kuzuyama, T., Hammerschmidt, F., Eguchi, T.
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 57 号: 33 ページ: 4963-4966
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.8b00614
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Biochemical and structural analysis of FomD that catalyzes the hydrolysis of cytidylyl (S)-2-hydroxypropylphosphonate in fosfomycin biosynthesis (2018)
  • 著者名/発表者名: Sato, S., Miyanaga, A., Kim, S. Y., Kuzuyama, T., Kudo, F., Eguchi, T.
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 57 号: 32 ページ: 4858-4866
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.8b00690
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural Basis of Protein-Protein Interactions between a trans-Acting Acyltransferase and Acyl Carrier Protein in Polyketide Disorazole Biosynthesis (2018)
  • 著者名/発表者名: Miyanaga Akimasa、Ouchi Risako、Ishikawa Fumihiro、Goto Ena、Tanabe Genzoh、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 140 号: 25 ページ: 7970-7978
  • DOI: 10.1021/jacs.8b04162
  • 査読あり
• [雑誌論文] Protein-protein interactions in polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase hybrid assembly lines (2018)
  • 著者名/発表者名: Miyanaga Akimasa、Kudo Fumitaka、Eguchi Tadashi
  • 雑誌名: Natural Product Reports 巻: 35 号: 11 ページ: 1185-1209
  • DOI: 10.1039/c8np00022k
  • 査読あり
• [雑誌論文] Carbon-free production of 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) in cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 (2018)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, S., Ozawa, H., Kato, H., Nimura-Matsune, K., Hirayama, T., Kudo, F., Eguchi, T., Kakinuma, K., Yoshikawa, H.
  • 雑誌名: Biosci. Biotech. Biochem. 巻: 82 号: 1 ページ: 161-165
  • DOI: 10.1080/09168451.2017.1411777
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] NAD+-Dependent Dehydrogenase PctP and PLP-Dependent Aminotransferase PctC Catalyze the First Post-glycosylation Modification of Sugar Intermediate in Pactamycin Biosynthesis (2018)
  • 著者名/発表者名: Akane Hirayama, Jinmiao Chu, Ena Goto, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi
  • 雑誌名: ChemBioChem 巻: 19 号: 2 ページ: 126-130
  • DOI: 10.1002/cbic.201700483
  • 査読あり
• [雑誌論文] Substrate Recognition by a Dual Functional P450 Monooxygenase Involved in FD-891 Biosynthesis (2017)
  • 著者名/発表者名: Akimasa Miyanaga, Ryuichi Takayanagi, Takashi Furuya, Ayano Kawamata, Tomohiro Itagaki, Yoshiharu Iwabuchi, Naoki Kanoh, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi
  • 雑誌名: ChemBioChem 巻: 18 号: 21 ページ: 2179-2187
  • DOI: 10.1002/cbic.201700429
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fosfomycin Biosynthesis via Transient Cytidylylation of 2-Hydroxyethylphosphonate by the Bifunctional Fom1 Enzyme (2017)
  • 著者名/発表者名: Su-Hee Cho, Seung-Young Kim, Takeo Tomita, Taro Shiraishi, Jin-Soo Park, Shusuke Sato, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi, Nobutaka Funa, Makoto Nishiyama, Tomohisa Kuzuyama
  • 雑誌名: ACS Chem. Biol. 巻: 12 号: 8 ページ: 2209-2215
  • DOI: 10.1021/acschembio.7b00419
  • 査読あり
• [雑誌論文] Methylcobalamin-Dependent Radical SAM C-Methyltransferase Fom3 Recognizes Cytidylyl-2-hydroxyethylphosphonate and Catalyzes the Nonstereoselective C-Methylation in Fosfomycin Biosynthesis (2017)
  • 著者名/発表者名: Sato Shusuke、Kudo Fumitaka、Kim Seung-Young、Kuzuyama Tomohisa、Eguchi Tadashi
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 56 号: 28 ページ: 3519-3522
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.7b00472
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural Analysis of the Dual Function Thioesterase SAV606 Unravels the Mechanism of Michael Addition of Glycine to an α,β-Unsaturated Thioester (2017)
  • 著者名/発表者名: Taichi Chisuga, Akimasa Miyanaga, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 292 号: 26 ページ: 10926-10937
  • DOI: 10.1074/jbc.m117.792549
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of a gene cluster for telomestatin biosynthesis and heterologous expression using a specific promoter in a clean host. (2017)
  • 著者名/発表者名: 4.Amagai, K., Ikeda, H., Hashimoto, J., Kozone, I., Izumikawa, M., Kudo, F., Eguchi, T., Nakamura, T., Osada, H., Takahashi, S., Shin-ya
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 7 号: 1 ページ: 3382-3382
  • DOI: 10.1038/s41598-017-03308-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Biochemical Characterization and Structural Insight into Aliphatic β-Amino Acid Adenylation Enzymes IdnL1 and CmiS6 (2017)
  • 著者名/発表者名: Jolanta Cieslak, Akimasa Miyanaga, Ryoma Takaku, Makoto Takaishi, Keita Amagai, Fumitaka Kudo, Tadashi Eguchi
  • 雑誌名: Proteins 巻: 85 号: 7 ページ: 1238-1247
  • DOI: 10.1002/prot.25284
  • 査読あり
• [雑誌論文] Substrate Specificity of Radical S-Adenosyl-L-methionine Dehydratase AprD4 and Its Partner Reductase AprD3 in the C3′-Deoxygenation of Aminoglycoside Antibiotics (2017)
  • 著者名/発表者名: Fumitaka Kudo, Takeshi Tsunoda, Makoto Takashima, Tadashi Eguchi
  • 雑誌名: J. Antibiot. 巻: 70 号: 4 ページ: 423-428
  • DOI: 10.1038/ja.2016.110
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Study on radical SAM C-methyltransferase Fom3 in fosfomycin biosynthesis (2019)
  • 著者名/発表者名: Fumitaka Kudo
  • 学会等名: 2nd China-Japan Joint Symposium on Natural Product Biosynthesis
  • 国際学会
• [学会発表] カナマイシン生合成における脱水素酵素KanD2の基質認識機構 (2019)
  • 著者名/発表者名: 北山 幸延、宮永 顕正、工藤 史貴、江口 正
  • 学会等名: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [学会発表] 抗腫瘍抗生物質パクタマイシンの生合成におけるアデニル化酵素と糖転移酵素の機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 張 家浩、平山 茜、工藤 史貴、江口 正
  • 学会等名: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [学会発表] Radical SAM C-Methylation in Fosfomycin Biosynthesis (2019)
  • 著者名/発表者名: SATO, Shusuke; KUDO, Fumitaka; KUZUYAMA, Tomohisa; EGUCHI, Tadashi
  • 学会等名: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [学会発表] ジソラゾール生合成におけるアシル基転移酵素とアシルキャリアプロテイン間の相互作用解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 後藤 絵菜、大内 理紗子、宮永 顕正、工藤 史貴、江口 正
  • 学会等名: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [学会発表] 18員環マクロライド抗生物質Virustomycin Aの生合成遺伝子クラスター (2019)
  • 著者名/発表者名: 岸川 皓典、宮永 顕正、工藤 史貴、江口 正
  • 学会等名: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [学会発表] マクロラクタム抗生物質クレミマイシン生合成におけるsplit DHドメインの機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 川崎 大輔、千菅 太一、宮永 顕正、工藤 史貴、江口 正
  • 学会等名: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [学会発表] Functional and structural analysis of unique adenylation enzyme IdnL7 involved in biosynthesis of macrolactam antibiotic incednine (2019)
  • 著者名/発表者名: CIESLAK, Jolanta; MIYANAGA, Akimasa; KUDO, Fumitaka; EGUCHI, Tadashi
  • 学会等名: 日本化学会第99春季年会(2019)甲南大学 岡本キャンパス
• [学会発表] ホスホマイシン生合成における新規加水分解酵素FomDの機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 秀亮、宮永 顕正、工藤 史貴、葛山 智久、江口 正
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年度大会 東京農業大学
• [学会発表] Study on a dual functional cytochrome P450 in the biosynthesis of macrolide antibiotic FD-891 (2018)
  • 著者名/発表者名: Fumitaka Kudo, Akimasa Miyanaga, Tadashi Eguchi
  • 学会等名: 3rd European Conference on Natural Products
  • 国際学会
• [学会発表] Biosynthesis of aminoglycoside antibiotics (2018)
  • 著者名/発表者名: Fumitaka Kudo
  • 学会等名: 1st Japanese-German Symposium, Biosynthesis and Function of Natural Products
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 抗腫瘍抗生物質パクタマイシンの生合成研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 工藤 史貴、平山 茜、張 家浩、宮永 顕正、江口 正
  • 学会等名: 第60回天然有機化合物討論会
• [学会発表] Biosynthesis of β-amino acid containing macrolactam antibiotics (2018)
  • 著者名/発表者名: Fumitaka Kudo
  • 学会等名: The Society for Industrial Microbiology, “2nd International Conference on Natural Product Discovery and Development in the Genomic Era”
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] ポリケチド生合成におけるアシル基転移酵素とアシルキャリアタンパク質のクロスリンク反応の検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 大内理紗子、石川文洋、後藤絵菜、木村真希、宮永顕正、田邉元三、工藤史貴、江口正
  • 学会等名: 日本化学会第98春季年会（2018）（日本大学理工学部 船橋キャンパス）
• [学会発表] Radical SAM enzymes involved in natural product biosynthesis (2017)
  • 著者名/発表者名: Fumitaka Kudo
  • 学会等名: The 18th International Symposium on the Biology of Actinomycetes (ISBA18), Natural Products; Discovery and Biosynthesis I
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] ホスホマイシン生合成におけるC-メチル化機構 (2017)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 秀亮、 Kim Seung-Young、葛山 智久、工藤 史貴、江口 正
  • 学会等名: 第59回天然有機化合物討論会（2017）
• [学会発表] Biosynthesis of Carbocyclic Nucleoside Aristeromycin (2017)
  • 著者名/発表者名: Fumitaka Kudo
  • 学会等名: 1st China-Japan Joint Symposium on Natural Product Biosynthesis
  • 国際学会 / 招待講演