| 研究領域 | ノンコーディングRNAネオタクソノミ |
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| 研究課題/領域番号 |
17H05592
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
西増 弘志 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (00467044)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2018年度)
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| 配分額 *注記 |
8,320千円 (直接経費: 6,400千円、間接経費: 1,920千円)
2018年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2017年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
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| キーワード | CRISPR / 結晶構造 / CRISPR-Cas / 高速AFM / 蛋白質 / 核酸 |
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| 研究実績の概要 |
CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAエンドヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し、ガイドRNAと相補的な2本鎖DNAを選択的に切断する。したがって、Cas9を用いることにより、ゲノムDNAの狙った位置を切断し、その周辺の塩基配列を改変すること（ゲノム編集）が可能である。しかし、Cas9が標的DNAを認識するためには、ガイドRNAと標的DNAとの間の相補性にくわえ、PAMとよばれる特定の塩基配列が必要である。ゲノム編集に利用されているS. pyogenes由来Cas9（SpCas9）はNGG（Nは任意の塩基）という塩基配列をPAMとして必要とするため、ゲノム編集の適用範囲には制限が存在していた。そこで、SpCas9に7つのアミノ酸変異を導入することにより、NGGにくわえ、NGA、NGT、NGCをPAMとして認識するCas9改変体（SpCas9-NG）を作製した。SpCas9またはSpCas9-NGとガイドRNAをヒト培養細胞に発現させ、NGA、NGT、NGG、または、NGCをPAMとしてもつ標的部位への変異の導入を調べた。SpCas9はNGGをPAMとしてもつ標的部位に効率よく変異を誘導した一方、NGTおよびNGCをPAMとしてもつ標的部位には変異を誘導しなかった。SpCas9と対照的に、SpCas9-NGはNGGだけでなくNGHをPAMとしてもつ標的部位に変異を誘導した。さらに、SpCas9-NG（D10A変異体）とシチジンデアミナーゼの融合タンパク質（Target-AID-NG）をヒト培養細胞に発現させ、NGA、NGT、NGG、または、NGCをPAMとしてもつ標的部位の塩基置換を調べた結果、Target-AID-NGはNGNをPAMとしてもつ標的部位に塩基置換を誘導することが明らかになった。以上の結果から、SpCas9-NGを利用することにより、ゲノム編集の適用範囲を従来の約4倍に拡張することに成功した。
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| 現在までの達成度 (段落) |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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