新規リシール細胞技術を用いた複数タンパク質・膜不透過性中分子の細胞内導入法の開発

• 研究領域: 動的構造生命科学を拓く新発想測定技術－タンパク質が動作する姿を活写する－
• 研究課題/領域番号: 17H05870
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 複合領域
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 村田 昌之 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (50212254)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2019-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2018年度)
• 配分額: 13,000千円 (直接経費: 10,000千円、間接経費: 3,000千円); 2018年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円); 2017年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
• キーワード: セミインタクト細胞リシール法 / 中分子導入法 / 病態モデル細胞 / 細胞内操作技術 / リシール細胞技術 / セミインタクト細胞 / 細胞内物質導入技術

研究実績の概要

われわれは、細胞膜を透過性にして細胞質交換を可能にした「セミインタクト細胞リシール技術」を開発し、細胞内への生体物質導入法や導入した物質の様々な細胞内生命現象への影響などを光学顕微鏡下で可視化解析するマルチスケール解析を中心とした様々な解析システムを構築している。この細胞内操作技術は、多種類のタンパク質成分や膜不透過性の(天然)化合物・低分子化合物・中分子(特殊機能ペプチドや機能性核酸など)を、同時に定量的に細胞内に導入することが可能であり、かつオルガネラや細胞骨格の構造とトポロジーが保持されているため、導入されたタンパク質（群）の様々な動的平衡状態を「真の細胞環境内に近い状態で」計測できる。今年度は、研究計画に沿って、2種類の細胞内導入法(SLO型及びLLO型リシール法)を構築し、その最適化と性能比較を行った。その結果、2種類のリシール法を用い、膜不透過性の低分子・中分子・タンパク質・細胞質など、広いサイズ範囲の物質を、細胞質依存的に(SLO型)、細胞質非依存的に(LLO型)に細胞内に導入するシステムを完成させることができた。また、導入した物質の細胞機能に与える影響を生化学的に検定すル様々な生化学的・細胞生物学的手法の加え、導入物質によって影響を受ける細胞の「状態」変化を、細胞内のタンパク質分子ネットワーク(正確には、共変動分子ネットワーク)として記述するための解析手法(マルチスケール解析法)の応用環境の整備も行った。さらに、SLO型リシール法を用いて作成した、正常または病態モデル細胞に対し、LLO型リシール法を使って様々な低分子・中分子を追加導入することで、低分子・中分子を病態環境でスクリーニングし構造・機能解析するシステムも構築した。これら知見を基に、2種類のリシール法の性能・特長を比較し、幾つかの和文・英文の総説として発表した。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Phosphatidylinositol-3-phosphate-mediated actin domain formation linked to DNA synthesis upon insulin treatment in rat hepatoma-derived H4IIEC3 cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Kano, F., Murata, M.
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Mol. Cell Res. 巻: 1866 号: 5 ページ: 793-805
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2019.02.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Changes in the asymmetric distribution of cholesterol in the plasma membrane influence streptolysin O pore formation (2019)
  • 著者名/発表者名: Ogasawara, F., Kano, F., Murata, M., Kimura, Y., Kioka, N., Ueda, K
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 9 号: 1 ページ: 4548-4548
  • DOI: 10.1038/s41598-019-39973-x
  • NAID: 120006644065
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The cell resealing technique for manipulating, visualizing, and elucidating molecular functions in living cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kunishige, R., Kano, F., Murata, M.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Acta (General Subjects) 巻: 印刷中 号: 2 ページ: 129329-129329
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.03.015
  • 査読あり
• [雑誌論文] Single-molecule diffusion-based estimation of ligand effects on G protein?coupled receptors (2018)
  • 著者名/発表者名: Yanagawa Masataka、Hiroshima Michio、Togashi Yuichi、Abe Mitsuhiro、Yamashita Takahiro、Shichida Yoshinori、Murata Masayuki、Ueda Masahiro、Sako Yasushi
  • 雑誌名: Science Signaling 巻: 11 号: 548 ページ: 1-16
  • DOI: 10.1126/scisignal.aao1917
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Exosome-associated Shiga toxin 2 is released from cells and causes severe toxicity in mice (2018)
  • 著者名/発表者名: Watanabe-Takahashi, M., Yamasaki, S., Murata, M., Kano, F., Motoyama, J., Yamate, J., Omi, J., Sato, W., Ukai, H., Shimasaki, K., Ikegawa, M., Tamura-Nakano, M., Yanoshita, R., Nishino, Y., Miyazawa, A., Natori, Y., Toyama-Sorimachi, N., Nishikawa, N.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 8 号: 1 ページ: 10776-10776
  • DOI: 10.1038/s41598-018-29128-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] セミインタクト細胞リシール技術の新展開：「再構成」から「細胞編集」まで (2018)
  • 著者名/発表者名: 村田昌之、加納ふみ
  • 雑誌名: 生化学 巻: 90 ページ: 433-443
  • NAID: 40021670407
• [雑誌論文] セミインタクト細胞リシール技術を用いた細胞機能解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 國重莉奈、加納ふみ、村田昌之
  • 雑誌名: 生体の科学 巻: 69 ページ: 247-251
• [雑誌論文] セミインタクト細胞リシール技術を用いた糖尿病モデル細胞アレイとその解析法 (2018)
  • 著者名/発表者名: 加納ふみ、野口誉之、村田昌之
  • 雑誌名: 『臓器チップの技術と開発動向』（酒井康行、金森敏幸監修） 巻: - ページ: 222-229
• [雑誌論文] LLO-mediated Cell Resealing System for Analyzing Intracellular Activity of Membrane-impermeable Biopharmaceuticals of Mid-sized Molecular Weight (2018)
  • 著者名/発表者名: Murakami Masataka、Kano Fumi、Murata Masayuki
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 8 号: 1 ページ: 1946-1946
  • DOI: 10.1038/s41598-018-20482-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The first successful observation of in-cell NMR signals of DNA and RNA in living human cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamaoki Yudai、Kiyoishi Ayaka、Miyake Masayuki、Kano Fumi、Murata Masayuki、Nagata Takashi、Katahira Masato
  • 雑誌名: Phys Chem Chem Phys 巻: 20 号: 5 ページ: 2982-2985
  • DOI: 10.1039/c7cp05188c
  • NAID: 130007557810
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Establishment and phenotyping of disease model cells created by cell-resealing technique (2017)
  • 著者名/発表者名: Kano Fumi、Noguchi Yoshiyuki、Murata Masayuki
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 号: 1 ページ: 15167-15167
  • DOI: 10.1038/s41598-017-15443-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Single-molecule fluorescence imaging of RalGDS on cell surfaces during signal transduction from Ras to Ral (2017)
  • 著者名/発表者名: Yoshizawa R, Umeki N, Yanagawa M, Murata M, Sako Y
  • 雑誌名: Biophysics and Physicobiology 巻: 14 号: 0 ページ: 75-84
  • DOI: 10.2142/biophysico.14.0_75
  • NAID: 130007040995
  • ISSN: 2189-4779
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Pyruvate kinase M1 interacts with A-Raf and inhibits endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by activating MEK1/ERK pathway in mouse insulinoma cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Horiuchi Yuta、Nakatsu Daiki、Kano Fumi、Murata Masayuki
  • 雑誌名: Cellular Signalling 巻: 38 ページ: 212-222
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2017.07.017
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel prosurvival function of Yip1A in human cervical cancer cells: constitutive activation of the IRE1 and PERK pathways of the unfolded protein response (2017)
  • 著者名/発表者名: Yuki Taguchi, Yuta Horiuchi, Fumi Kano, Masayuki Murata
  • 雑誌名: Cell Death and Disease 巻: 8 号: 3 ページ: e2718-e2718
  • DOI: 10.1038/cddis.2017.147
  • 査読あり / オープンアクセス
• [産業財産権] エクソソームの製造方法及びその製造方法によって得られるエクソソーム (2019)
  • 発明者名: 加納ふみ、村田昌之、園田雄輝
  • 権利者名: 東京工業大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2019
  • 外国
• [産業財産権] エクソソームの製造方法及びその製造方法によって得られるエクソソーム (2018)
  • 発明者名: 加納ふみ、村田昌之、園田雄輝
  • 権利者名: 東京工業大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2018
  • 取得年月日: 2018
• [産業財産権] Cas9-gRNA複合体の製造方法、Cas9-gRNA複合体の細胞核内への導入方法、及び細胞内における標的遺伝子の改変方法 (2017)
  • 発明者名: 村田昌之、加納ふみ、村上真隆
  • 権利者名: 東京大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2017
  • 外国
• [産業財産権] 導入剤、キット、物質導入方法、及びスクリーニング方法 (2017)
  • 発明者名: 村田昌之、加納ふみ、村上真隆
  • 権利者名: 東京大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2017
  • 外国